Doctor en Farmacología / El alcoholismo es una de las adicciones de mayor prevalencia en el mundo. Sin embargo, se ha visto que la presencia de ciertos polimorfismos en los genes de las enzimas que metabolizan el etanol, son capaces de proteger a sus portadores de desarrollar esta enfermedad. En humanos el etanol es metabolizado principalmente en el hígado por la deshidrogenasa alcohólica (ADH) generando acetaldehído, metabolito que es oxidado a acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). En algunos individuos de la población asiática, una mutación puntual en el gen de la ALDH2 (ALDH2*2) elimina la actividad de esta enzima, lo que produce una gran acumulación de acetaldehído en la sangre luego del consumo de bebidas alcohólicas. Este aumento de los niveles sanguíneos de acetaldehído genera marcados efectos disfóricos que provocan un rechazo al consumo de alcohol. Por otra parte, los individuos que poseen una variante rápida de la ADH (ADH1B*2; 47His) presentan también una marcada protección contra el alcoholismo respecto a portadores de la enzima normal (ADH1B*1; 47Arg). A pesar de que la enzima rápida ADH1B*2 tiene una Vmax 100 veces mayor que la enzima normal ADH1B*1, los individuos portadores del alelo ADH1B*2 no presentan una mayor velocidad de eliminación del etanol y tampoco niveles aumentados de acetaldehído (medidos en sangre venosa) que expliquen su protección al alcoholismo. En esta tesis se desarrolló un modelo animal en ratas bebedoras de alcohol que, al expresar una ADH de elevada actividad por entrega génica, podría ayudar a entender los mecanismos involucrados en la protección al alcoholismo observada en portadores de la enzima rápida ADH1B*2. Para ello, el cDNA de la ADH silvestre de rata (rADH- 47Arg) se mutó para codificar una enzima de rata (rADH-47His), análoga a la enzima humana ADH1B*2. Con este material genético se construyeron vectores plasmidiales y adenovirales que permitieron expresar el gen de la enzima ADH de rata mutada (rADH-47His) y ADH silvestre (rADH-47Arg) en células de riñón humano, en hepatoma de rata y en el hígado de ratas bebedoras de alcohol de la línea UChB. La transfección de células de riñón humano (que no expresan actividad ADH endógena) con el cDNA de rADH-47His resultó en la expresión de una ADH con una Km 10 veces mayor (p<0,001) para NAD+ y una Ki 2 veces mayor (p<0,001) para NADH que la observada al transfectar el cDNA de rADH-47Arg. Estos cambios en la afinidad por tales co-factores son análogos a los que produce la mutación natural (Arg47His) en la enzima humana ADH1B*2. La transducción in vitro de células de hepatoma de rata en cultivo con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg mostró que ambos vectores se expresan en células hepáticas y que la Vmax de la enzima mutada rADH-47His es 8 veces mayor que la de la enzima silvestre rADH-47Arg. En estudios in vivo, se administraron los vectores adenovirales codificantes de rADH-47His y rADH-47Arg a ratas bebedoras de la línea UChB. Las ratas transducidas por vía intravenosa (5 x 1012 pv/kg) con los vectores AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron respectivamente un aumento de 90% (p<0,01) y 30% (p<0,01) en la actividad hepática de la ADH. Al recibir una dosis estándar de etanol (1 g/kg, i.p.), las ratas transducidas con los vectores AdVrADH- 47His y AdV-rADH-47Arg mostraron un aumento transitorio en los niveles arteriales de acetaldehído, con valores máximos a los 2,5 minutos de recibir etanol, niveles que fueron respectivamente 5 veces (p<0,001) y 3,5 veces (p<0,001) más altos que los detectados en los animales controles. Las ratas transducidas con los vectores adenovirales AdV-rADH-47His y AdV-rADH-47Arg presentaron además una marcada reducción de 50% (p<0,001) y 30% (p<0,01) en el consumo voluntario de alcohol. Los resultados obtenidos en esta tesis indican que, en ratas, la expresión de una deshidrogenasa alcohólica de elevada actividad (rADH-47His), análoga a la enzima humana rápida ADH1B*2, resulta en un aumento transitorio del acetaldehído en sangre arterial al recibir etanol y en una disminución en el consumo voluntario de alcohol. Estos resultados podrían explicar el mecanismo de protección del alcoholismo en humanos asociado a la enzima ADH1B*2 y dar origen a nuevas estrategias terapéuticas para esta enfermedad / Alcoholism is one of the most prevalent types of drug dependence in the world. However, there is evidence that individuals bearing certain polymorphisms in genes coding for enzymes involved in the metabolism of ethanol are protected against this condition. In humans, ethanol is metabolized mainly by hepatic alcohol dehydrogenase (ADH) to acetaldehyde, which is oxidized to acetate by mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2). In some East Asians, a point mutation in the ALDH2 gene (ALDH2*2) abolishes the activity of this enzyme and upon ethanol consumption results in marked elevations of blood acetaldehyde. This increase in blood acetaldehyde levels lead to marked dysphoric effects that deter individuals to continue drinking. Another important polymorphism is that carried by individuals bearing a fast variant of ADH (ADH1B*2; Arg47His) which show also a marked protection against alcoholism. In spite of the 100-fold higher Vmax of ADH1B*2 (47His) vs. ADH1B*1(47Arg), individuals who carry the ADH1B*2 allele show neither an increased rate of ethanol elimination nor higher blood acetaldehyde levels upon ethanol intake. Thus, the mechanism that leads to this marked protection against alcoholism is unknown. The aim of this work was to investigate the possible mechanism by which the ADH1B*2 allele protects against alcoholism. This was studied in rats bred for their high ethanol intake, which underwent transduction with a rat analogue of human ADH1B*2. For this purpose, the rat wild type cDNA coding for ADH (rAdh-47Arg) was mutated to encode His47 (rAdh-47His). This genetic material was incorporated into suitable plasmids and adenoviral vectors, which were used to express the mutated (rADH-47His) and wild type rat ADH (rADH-47Arg) genes into (i) human embryonic kidney cells, (ii) rat hepatoma cells and (iii) liver of UChB alcohol-preferring rats. The transduction of human embryonic kidney cells, which lack ADH activity, with rADH- 47His cDNA leads to the expression of an ADH that shows a 10-fold (p<0,001) higher Km for NAD+ and a 2-fold (p<0,001) higher Ki for NADH than those observed when expressing the wild type rADH-47Arg. These changes in the affinity for nicotinamide adenine dinucleotides were found to be analogous to those produced in the human enzyme ADH1B*2 by the Arg47His aminoacidic change. The in vitro transduction of rat hepatoma cells with the AdV-rADH-47His or AdV-rADH- 47Arg adenoviral vectors confirmed the ability of both vectors to generate active ADHs. The Vmax of rADH-47His was 8-fold higher than that of rADH-47Arg. Liver ADH activity in UChB alcohol-preferring rats transduced in vivo with the AdV-rADH-47His or AdVrADH- 47Arg adenoviral vectors was increased 90% (p<0,01) and 30% (p<0,01) respectively. Upon the administration of ethanol (1 g/kg, i.p.) to rats that received either AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg, showed a marked surge (burst) in arterial acetaldehyde level, reaching maximal levels 2,5 minutes after ethanol injection. These levels were, respectively, 5- and 3.5-fold higher (P<0.001) than those of control animals. Rats that received the AdV-rADH-47His or AdV-rADH-47Arg vectors showed, respectively, a reduction of 50% (p<0,001) and 30% (p<0,01) in their voluntary ethanol intake. The present study in animals transduced with the rat equivalent of human ADH1B*2 shows that high levels of arterial acetaldehyde occur only during the first few minutes of ethanol metabolism, which could be responsible for the reduction in voluntary ethanol intake seen in these animals. These observations may constitute the basis of the protection against alcoholism seen in humans who carry the ADH1B*2 allele, and would provide elements for new therapeutic strategies against alcoholism

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El riesgo individual de alcoholismo tiene un componente hereditario de 40 a 60%. Los únicos factores genéticos bien establecidos para una susceptibilidad diferenciada al alcoholismo son polimorfismos en los genes de las principales enzimas del metabolismo del etanol, la deshidrogenasa alcohólica (ADH) y la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). Las variantes polimórficas de estas enzimas difieren en sus propiedades catalíticas y en sus distribuciones étnicas. El etanol es metabolizado en el hígado a acetaldehído por la ADH y luego a acetato por la ALDH2. En portadores de una ALDH2 inactiva (ALDH2*2) el acetaldehído, en lugar de degradarse, se acumula en el cuerpo produciendo reacciones desagradables que evitan una ingesta excesiva de alcohol. Se postula que los portadores de las variantes rápidas de la ADH (ADH1C1, ADH1B2) también experimentan un alza de acetaldehído corporal luego de consumir etanol, teniendo así una protección genética contra el alcoholismo. En contraste, los portadores de las ADHs lentas (ADH1C2 o ADH1B1) o de la ALDH2 de gran actividad (ALDH2*1) tienen un mayor riesgo de alcoholismo. La variante inactiva de la ALDH2 (ALDH2*2) es exclusiva de la población del este de Asia (40%), que tiene además frecuencias altas de los alelos protectores ADH1C*1 (90%) y ADH1B*2 (70%), mientras que las poblaciones caucásicas tienen frecuencias menores de estos alelos (50% y 5%, respectivamente). Para determinar si los alelos ADH1C*2 o ADH1B*1 de la deshidrogenasa alcohólica (ADHs lentas) aumentan el riesgo de alcoholismo en la población chilena se determinaron los genotipos de la ADH1C y la ADH1B en pacientes alcohólicos (n = 30) y población chilena general (n = 105). Se amplificaron segmentos específicos de estos genes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se analizaron las variaciones codificantes de cambios aminoacídicos mediante digestión con enzimas de restricción, separando los fragmentos resultantes por tamaño mediante electroforesis (RFLP). Se evaluó la significación estadística de las diferencias encontradas entre los grupos en las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes ADH1C y ADH1B. La frecuencia del alelo ADH1C*2 es significativamente mayor (p < 0,04) en pacientes alcohólicos (0,40) que en la población general (0,26), aumentando casi al doble el riesgo de alcoholismo (OR = 1,96) respecto del alelo ADH1C*1. La frecuencia genotípica de los homocigotos ADH1C*2/*2 es también mayor (p < 0,05) en pacientes alcohólicos (0,14) que en la población general (0,07), teniendo estos individuos un riesgo de alcoholismo casi cuatro veces mayor (OR = 3,85) que los homocigotos ADH1C*1/*1. Las frecuencias del alelo ADH1B*1 son prácticamente idénticas en ambos grupos (alrededor de 0,95), haciendo imposible determinar si éste aumenta el riesgo de alcoholismo en la población chilena, dado el tamaño muestral empleado. Se analizaron cinco variaciones nucleotídicas adicionales, lo que permitió encontrar en la población chilena una variante del alelo ADH1C*2 exclusiva de la población nativa de América (ADH1C*2Thr351) y describir por primera vez la existencia de dos variantes nuevas del alelo ADH1B*1. La variante ADH1B*1Ser59 incorpora un polimorfismo (A5226T) antes reportado aisladamente y la variante ADH1B*1Arg367 incorpora una mutación encontrada aquí (T15490G). No se encontró evidencia de que estas variantes modifiquen el riesgo de alcoholismo en la población chilena, pero sí se encontró una tendencia hacia un riesgo aumentado de alcoholismo para el alelo ADH1C*2Thr351, al compararlo con los alelos ADH1C*1 y ADH1C*2 en conjunto. A partir de los resultados de esta memoria se pueden emitir tres conclusiones. (I) El alelo ADH1C*2 y el genotipo ADH1C*2/*2 aumentan el riesgo de alcoholismo en la población chilena respecto del alelo ADH1C*1 y el genotipo ADH1C*1/*1. (II) El genotipo de la ADH1C se puede determinar analizando sólo la posición nucleotídica 11939 (aa 271) y no la posición 15115 (aa 349), ya que sus identidades están perfectamente asociadas (11939A / 15115G y 11939G / 15115A) y porque el análisis de la posición nucleotídica 11939 tiene una mayor fortaleza en su diseño experimental por a) tener reacciones positivas para las dos identidades nucleotídicas (A y G) de esta posición y b) determinar un cambio aminoacídico de mayor importancia por encontrarse en el sitio activo de la enzima. (III) El genotipo de la ADH1B puede ser excluido del análisis del aumento del riesgo de alcoholismo conferido por las variantes lentas de la ADH en la población chilena porque su diferencia entre grupos es mínima.