Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A aplicabilidade de um método selecionado de medição indireta de vitelogenina (Vtg) em plasma sanguíneo de peixe, baseado na quantificação de fosfato álcali-lábil (alkali-labile phosphate-ALP) para acessar estrogenicidade em água, foi investigada na presente tese. O método foi originalmente desenvolvido para a espécie de peixe Carassius carassius (Carpa cruciana) e aplicado pela primeira vez na espécie Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo) no presente estudo. Com o objetivo de acessar a sensibilidade do método, em uma primeira etapa da investigação foram realizados estudos laboratoriais com soluções estoques de 17-ethinylestradiol (EE2), 17-estradiol (E2), e estrona (E1). Os efeitos destes hormônios foram investigados com base tanto na concentração quanto na carga, utilizando-se para tanto, unidades experimentais com volumes distintos (2 L e 130 L). Após a validação do método de ALP, a estrogenicidade foi avaliada nas seguintes águas contaminadas: (i) afluente e efluente de uma grande estação de tratamento de esgotos convencional (ETE) e de uma estação descentralizada de tratamento de esgoto de pequeno porte (Ecossistema Engenheirado-DEE); (ii) água superficial (SW) e água subterrânea (GW) coletadas em uma área de brejo contaminada com gasolina; (iii) água de uma lagoa urbana (LRF) da cidade do Rio de Janeiro, com alta densidade populacional e descarte clandestino de esgoto. Na segunda etapa foram analisados em microalgas os efeitos (outros que não disrupção endócrina) causados pelos hormônios EE2, E2 e E1. Os hormônios foram testados individualmente e em misturas, em culturas individuais e combinada (S+) das espécies de microalgas unicelulares P. subcapitata e D. subspicatus. Com base nos níveis de ALP para a espécie de peixe e no EC50 para as espécies de algas, os resultados mostraram que o EE2 e o E2 causaram disrupção endócrina superior e foram mais tóxicos do que o E1 para peixes e microalgas respectivamente. Quando em misturas (E+) de concentrações equivalentes (EE2:E2:E1), os estrogênios resultaram em efeito aditivo para as espécies O. niloticus e P. subcapitata, e menos que aditivo para D. subspicatus e cultivo misto de algas (S+). Culturas contendo ambas as espécies de algas (S+) por um longo período de exposição (96 h) resultaram na atenuação dos efeitos tóxicos causados pela exposição, tanto individual (EE2, E2 ou E1), quanto na mistura (E+) dos estrogênios, medidos em termos de EC50 (T0h 0,07; 0,09; 0,18; e 0,06 g mL-1; e T96h 1,29; 1,87; 5,58; e 4,61 g mL-1, respectivamente). O DEE apresentou uma maior eficiência na remoção dos disrutores endócrinos do que a ETE convencional. Foi detectada estrogenicidade em amostras da LRF, e de água SW e GW em área brejosa contaminada com gasolina. Os resultados dos ensaios sugerem que as interações (efeitos aditivos ou menos que aditivo) causadas pela mistura dos estrogênios assim como, as interações entre as espécies de algas afetaram o resultado final dos ensaios ecotoxicológicos. Um fator raramente abordado em estudos ecotoxicológicos que foi destacado na presente tese refere-se à importância de considerar não somente a concentração e a dosagem, mas também a carga aplicada e o volume das unidades experimentais. Devido à boa sensibilidade do O. niloticus quando exposto às concentrações relativamente baixas dos estrogênios, a combinação do método de ALP com os biomarcadores auxiliares (particularmente MN) pode ser um protocolo adequado para a detecção de estogenicidade e genotoxicidade respectivamente em diferentes ambiente aquáticos contaminados, como parte de um programa de monitoramento ambiental / The applicability of one selected method for indirect measurement of vitellogenin (Vtg) in fish plasma based on the quantification of alkali-labile phosphates (ALP method) to assess estrogenicity in water was investigated. The ALP method applied in this investigation was originally developed with Carassius carassius (Crucian carps). This thesis describes the first attempt of using this method with Oreochromis niloticus (Nile tilapia). In a first part of the investigation, laboratory studies were conducted with water spiked with 17-ethinylestradiol (EE2), 17-estradiol (E2), and estrone (E1) in order to assess the method sensitivity. The effects of these estrogens were investigated on the basis of both load and concentration, using experimental units with two different volumes (2 L and 130 L). After validation of the method, the estrogenicity of the following contaminated waters was assessed: (i) affluent and effluent of one large conventional municipal wastewater treatment plant (WWTP) and one small decentralized wastewater treatment plant (Decentralized Engineered Ecosystem-DEE); (ii) surface water (SW) and groundwater (GW) obtained from a gasoline-contaminated marshland; (iii) samples from a urban lagoon (LRF) located in Rio de Janeiro city with high density population and clandestine sewage discharge. An additional goal of the thesis was to assess the effect (other than endocrine disruption) caused by EE2, E2 and E1 to microalgae. Assays with single and mixed estrogens and single and combined cultures (S+) of the green microalgae P. subcapitata and D. subspicatus were carried out. The results have shown that EE2 and E2 were more estrogenic and toxic than E1 to the fishes and to the microalgae respectively. Mixed solutions of estrogens (E+) in equal proportions (EE2:E2:E1) resulted in additive effect on O. niloticus and P. subcapitata and less-than-additive effect on D. subspicatus and S+ measured as ALP (for fish) and EC50 (for microalgae). Combined cultivation of both algae species and longer exposure time (96 h) resulted in attenuation of the toxic effects caused by single (EE2, E2 or E1) and mixed (E+) estrogens according to EC50 (T0h 0.07, 0.09, 0.18, and 0.06 g mL-1; and T96h 1.29, 1.87, 5.58, and 4.61 g mL-1, respectively). The decentralized engineered ecosystem was more efficient than the conventional WWTP regarding estrogenicity removal from the final effluent. Estrogenicity was detected in some samples of the LRF and the SW and GW of the gasoline-contaminated marshland. Therefore, the investigations suggested that interactions (additive and less-than additive effect) take place when different estrogens are present in the water environment and interactions also occur between algae species, which affect the final toxicity. Additionally, the study highlighted the importance of taking into account not only concentration and dose regime but also the mass load and therefore, the volume used in the experimental units, which are rarely addressed in ecotoxicity assays. Considering the good sensitivity of O. niloticus exposed to relatively low concentrations of estrogens, the combination of the ALP method with auxiliary biomarkers (particularly MN) can be a suitable protocol for estrogenicity and genotoxicity detection in different contaminated waters as part of water environmental monitoring programs

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A aplicabilidade de um método selecionado de medição indireta de vitelogenina (Vtg) em plasma sanguíneo de peixe, baseado na quantificação de fosfato álcali-lábil (alkali-labile phosphate-ALP) para acessar estrogenicidade em água, foi investigada na presente tese. O método foi originalmente desenvolvido para a espécie de peixe Carassius carassius (Carpa cruciana) e aplicado pela primeira vez na espécie Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo) no presente estudo. Com o objetivo de acessar a sensibilidade do método, em uma primeira etapa da investigação foram realizados estudos laboratoriais com soluções estoques de 17-ethinylestradiol (EE2), 17-estradiol (E2), e estrona (E1). Os efeitos destes hormônios foram investigados com base tanto na concentração quanto na carga, utilizando-se para tanto, unidades experimentais com volumes distintos (2 L e 130 L). Após a validação do método de ALP, a estrogenicidade foi avaliada nas seguintes águas contaminadas: (i) afluente e efluente de uma grande estação de tratamento de esgotos convencional (ETE) e de uma estação descentralizada de tratamento de esgoto de pequeno porte (Ecossistema Engenheirado-DEE); (ii) água superficial (SW) e água subterrânea (GW) coletadas em uma área de brejo contaminada com gasolina; (iii) água de uma lagoa urbana (LRF) da cidade do Rio de Janeiro, com alta densidade populacional e descarte clandestino de esgoto. Na segunda etapa foram analisados em microalgas os efeitos (outros que não disrupção endócrina) causados pelos hormônios EE2, E2 e E1. Os hormônios foram testados individualmente e em misturas, em culturas individuais e combinada (S+) das espécies de microalgas unicelulares P. subcapitata e D. subspicatus. Com base nos níveis de ALP para a espécie de peixe e no EC50 para as espécies de algas, os resultados mostraram que o EE2 e o E2 causaram disrupção endócrina superior e foram mais tóxicos do que o E1 para peixes e microalgas respectivamente. Quando em misturas (E+) de concentrações equivalentes (EE2:E2:E1), os estrogênios resultaram em efeito aditivo para as espécies O. niloticus e P. subcapitata, e menos que aditivo para D. subspicatus e cultivo misto de algas (S+). Culturas contendo ambas as espécies de algas (S+) por um longo período de exposição (96 h) resultaram na atenuação dos efeitos tóxicos causados pela exposição, tanto individual (EE2, E2 ou E1), quanto na mistura (E+) dos estrogênios, medidos em termos de EC50 (T0h 0,07; 0,09; 0,18; e 0,06 g mL-1; e T96h 1,29; 1,87; 5,58; e 4,61 g mL-1, respectivamente). O DEE apresentou uma maior eficiência na remoção dos disrutores endócrinos do que a ETE convencional. Foi detectada estrogenicidade em amostras da LRF, e de água SW e GW em área brejosa contaminada com gasolina. Os resultados dos ensaios sugerem que as interações (efeitos aditivos ou menos que aditivo) causadas pela mistura dos estrogênios assim como, as interações entre as espécies de algas afetaram o resultado final dos ensaios ecotoxicológicos. Um fator raramente abordado em estudos ecotoxicológicos que foi destacado na presente tese refere-se à importância de considerar não somente a concentração e a dosagem, mas também a carga aplicada e o volume das unidades experimentais. Devido à boa sensibilidade do O. niloticus quando exposto às concentrações relativamente baixas dos estrogênios, a combinação do método de ALP com os biomarcadores auxiliares (particularmente MN) pode ser um protocolo adequado para a detecção de estogenicidade e genotoxicidade respectivamente em diferentes ambiente aquáticos contaminados, como parte de um programa de monitoramento ambiental / The applicability of one selected method for indirect measurement of vitellogenin (Vtg) in fish plasma based on the quantification of alkali-labile phosphates (ALP method) to assess estrogenicity in water was investigated. The ALP method applied in this investigation was originally developed with Carassius carassius (Crucian carps). This thesis describes the first attempt of using this method with Oreochromis niloticus (Nile tilapia). In a first part of the investigation, laboratory studies were conducted with water spiked with 17-ethinylestradiol (EE2), 17-estradiol (E2), and estrone (E1) in order to assess the method sensitivity. The effects of these estrogens were investigated on the basis of both load and concentration, using experimental units with two different volumes (2 L and 130 L). After validation of the method, the estrogenicity of the following contaminated waters was assessed: (i) affluent and effluent of one large conventional municipal wastewater treatment plant (WWTP) and one small decentralized wastewater treatment plant (Decentralized Engineered Ecosystem-DEE); (ii) surface water (SW) and groundwater (GW) obtained from a gasoline-contaminated marshland; (iii) samples from a urban lagoon (LRF) located in Rio de Janeiro city with high density population and clandestine sewage discharge. An additional goal of the thesis was to assess the effect (other than endocrine disruption) caused by EE2, E2 and E1 to microalgae. Assays with single and mixed estrogens and single and combined cultures (S+) of the green microalgae P. subcapitata and D. subspicatus were carried out. The results have shown that EE2 and E2 were more estrogenic and toxic than E1 to the fishes and to the microalgae respectively. Mixed solutions of estrogens (E+) in equal proportions (EE2:E2:E1) resulted in additive effect on O. niloticus and P. subcapitata and less-than-additive effect on D. subspicatus and S+ measured as ALP (for fish) and EC50 (for microalgae). Combined cultivation of both algae species and longer exposure time (96 h) resulted in attenuation of the toxic effects caused by single (EE2, E2 or E1) and mixed (E+) estrogens according to EC50 (T0h 0.07, 0.09, 0.18, and 0.06 g mL-1; and T96h 1.29, 1.87, 5.58, and 4.61 g mL-1, respectively). The decentralized engineered ecosystem was more efficient than the conventional WWTP regarding estrogenicity removal from the final effluent. Estrogenicity was detected in some samples of the LRF and the SW and GW of the gasoline-contaminated marshland. Therefore, the investigations suggested that interactions (additive and less-than additive effect) take place when different estrogens are present in the water environment and interactions also occur between algae species, which affect the final toxicity. Additionally, the study highlighted the importance of taking into account not only concentration and dose regime but also the mass load and therefore, the volume used in the experimental units, which are rarely addressed in ecotoxicity assays. Considering the good sensitivity of O. niloticus exposed to relatively low concentrations of estrogens, the combination of the ALP method with auxiliary biomarkers (particularly MN) can be a suitable protocol for estrogenicity and genotoxicity detection in different contaminated waters as part of water environmental monitoring programs