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Orientador: Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:03:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Couto_VeronicaMuniz_M.pdf: 2320216 bytes, checksum: fdeaa0b57898e701ff2245fa5c39eded (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os anestésicos locais (AL) são utilizados para se bloquear a sensação de dor em procedimentos clínicos e odontológicos. Porém, os AL são moléculas pequenas que facilmente se redistribuem no sitio de ação, limitando a duração da anestesia. A dibucaína (DBC) é um anestésico local da família das amino-amidas e tem uso predominante como anestésico tópico. Este trabalho teve por finalidade desenvolver um novo sistema de liberação sustentada para o anestésico local dibucaína baseado em lipossomas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada e colesterol com gradiente iônico transmembranar, para uso parenteral. Primeiramente, avaliamos uma metodologia analítica para quantificação de DBC por cromatografia líquida de alta eficiência. Entao, foram então desenvolvidas formulações de lipossomas unilamelares (LUV) e multivesiculares (LMVV) com gradiente iônico (citrato e sulfato), para encapsulação da DBC a 0,012%. As formulações foram caracterizadas quanto à eficiência de encapsulação (%EE) potencial zeta, diâmetro e polidispersão. O potencial zeta de todas as formulações foi sempre negativo (ca. -30 mV). Formulações de LUV contendo sulfato (LUVDBC5.5+sulfin/7.4ex) apresentaram %EE (62,6% ± 4,3) significativamente maior que as demais formulações. As LUV apresentaram tamanho médio de 500 nm, sendo mais estáveis e menos polidispersas que as LMVV. As formulações LUV foram selecionadas para a continuidade do estudo, sendo caracterizadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão e testadas quanto a sua estabilidade química, liberação in vitro, viabilidade celular e atividade antinociceptiva em camundongos. As micrografias das LUV confirmaram a formação de vesículas esféricas e unilamelares. Nenhuma formulação apresentou níveis de peroxidação lipídica significativa (> 0,5% de lipídios totais) durante 150 dias de armazenamento a 4oC. A formulação LUVDBC5.5+sulfin/7.4ex apresentou o melhor perfil de liberação sustentada in vitro e aumento significativo no tempo de bloqueio sensorial (27 h) in vivo, em comparação com solução de DBC (11 h) de igual concentração. Nos testes de viabilidade celular não houve mudança significativa no perfil da citotoxicidade induzida por DBC, encapsulada ou não. Portanto, nesse trabalho reportamos o preparo e caracterização de uma formulação lipossomal de liberação sustentada para DBC, com alta eficiência de encapsulação e capaz de promover um significativo aumento (ca. 2,5 vezes) no tempo de analgesia in vivo / Abstract: Local anesthetics (LA) are used in medical and dental procedures to decrease pain sensation. However, LA are small molecules that easily diffuse in the site of action, restricting the duration of anesthesia. Dibucaine (DBC) is an amino-amide local anesthetic, which major use as a topical agent. This study aimed the development of a new drug delivery system for dibucaine based on liposomes with transmembrane ion-gradient, for parenteral drug administration. First, an analytical methodology for DBC quantification through high performance liquid chromatography was determined. Then, large unilamellar (LUV) and multivesicular (MLVV) liposome formulations were prepared with internal ionic-gradients for the encapsulation of DBC (0.012 %). The formulations were characterized regarding their encapsulation efficiency (%EE), zeta potential, average size and polydispersity. The zeta potential of all formulations was always negative (ca. -30 mV). Sulfate-containing LUV formulations (LUVDBC5.5 sulfin/7.4out) showed 62.6% ± 4.3 EE, which was significantly higher than all other formulations. LUV presented an average size of 500 nm and proved to be less polidisperse and more stable than LMVV, being selected for further morphological (by transmission electron microscopy), storage chemical stability, in vitro release, cell viability and in vivo analgesic tests. Micrographs proved that LUVs were spherical and unilamellar shape. No formulation showed lipid peroxidation level higher than 0.5 % of total lipids during 150 days of storage at 4oC. LUVDBC5.5 sulfin/7.4out presented increased in vitro sustained release profile and significant increase in sensory block duration (27 h) in vivo, than a equivalent DBC solution (11 h). No changes in the cytotoxicity effect of the anesthetic were observed for DBC free or encapsulated. Therefore, this study reports the successful preparation and characterization of a liposomal formulation for the sustained release of DBC with high encapsulation efficiency and that is able to significantly prolong (ca. 2.5 times) the duration of analgesia in vivo / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Ciências

Orientador: Monica Alonso Cotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-09T02:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorite_GabrielaSimone_M.pdf: 4032219 bytes, checksum: 39e02a6480d15ab8181afea790350328 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Apresentamos nesta dissertação o estudo realizado em cristais de proteínas e membranas modelo (bicamadas lipídicas) utilizando microscopia de força atômica (AFM) como principal técnica de análise. Para os cristais de proteína foram adquiridas imagens topográficas e óticas com a finalidade de obtermos maiores informações sobre o processo de cristalização dos mesmos. No caso das membranas modelo investigamos sua interação com o anestésico local dibucaína (DBC) através de imagens de topografia e fase durante a adição gradual da DBC à solução em contato com a bicamada, além de medidas adicionais de cinética de adsorção e elasticidade. Os cristais de proteína forma preparados pelo método de difusão de vapor em gota posicionada. Para a realização das imagens dos cristais em sua solução de crescimento (altamente viscosa) foi desenvolvida uma metodologia com a finalidade de evitar o amortecimento da vibração da alavanca. Imagens topográficas do cristal de proteína da bactéria patogênica Mycobacterium Tuberculosis) mostraram que a técnica de AFM permite avaliar o grau de ordem cristalina, bem como a existência de defeitos. No cristal da proteína da bactéria Xylella Fastidiosa, foi observada a presença de uma superfície suave com alguns terraços e degraus com altura de aproximadamente 3nm. Também foram observadas formações anisotrópicas na superfície do cristal, em forma de nanofios, sugerindo uma rota diferente de cristalização em condições de baixa concentração de proteína. A partir dessa observação, variamos as condições de crescimento, revelando mudanças significativas nas taxas de crescimento ao longo das diferentes direções do cristal que favoreciam o aumento da anisotropia de forma. As bicamadas lipídicas foram preparadas a partir dos fosfolipídios: fosfatidilcolina de ovo (EPC) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) pelo método de fusão de vesículas. Imagens de topografia e fase foram adquiridas por AFM, tanto para caracterização topográfica, bem como para observação da ação da DBC (adicionada gradualmente durante a aquisição) sobre a bicamada. As imagens AFM mostram que as bicamadas EPC se formam em domínios sobre a mica e não apresentam um formato típico nem distribuição uniforme. Por outro lado, bicamadas de DMPC se formam em domínios extensos com multi camadas e de maneira mais homogênea quando comparadas com as bicamadas de EPC. No caso da EPC, observamos a ação da DBC em função do aumento de sua concentração e ao longo do tempo. A seqüência de imagens topográficas mostra o desaparecimento de arranjos lipídicos com o aumento da concentração de DBC. Também observamos que para concentrações elevadas (5mM) o efeito da DBC na membrana é muito drástico. Já para bicamadas de DMPC, observamos as alterações morfológicas para única concentração de DBC (5mM) ao longo do tempo. Neste caso, apesar da concentração elevada, o desaparecimento das bicamadas ocorreu lentamente em comparação com as bicamadas de EPC. Em ambos os casos, as imagens de fase mostram alterações na superfície da bicamada, indicando a alterações nas propriedades elásticas da bicamada na presença de DBC. Medidas de cinética de adsorção e elasticidade superficiais em monocamadas destes lipídios na presença de DBC pelo método de gota pendente corroboram esta hipótese / Abstract: In this work we report the study on protein crystallization mechanisms and the interaction of local anesthetic dibucaine (DBC) with lipids domains in model membranes by Atomic Force Microscopy (AFM). We have also used optical microscopy for crystals analysis as well as adsorption kinetics and elasticity measurements for the dibucaine-membrane interaction. Crystallized proteins were prepared by the sitting drop vapor diffusion method. Experimental procedures were developed for imaging the crystal in the very viscous solution where they grow, in order to prevent strong dampening of the cantilever vibration. Topographic images of the protein crystal of the pathogenic bacterium Mycobacterium Tuberculosis show that AFM can provide an evaluation of the crystalline quality and information on existing defects. Moreover, protein crystals of the phytopathogenic bacterium Xylella Fastidiosa were more thoroughly analyzed. The AFM topography of this protein crystal shows smooth surfaces with terraces and step edges about ~3nm high. We also observed anisotropic structures on the surface (nanowires), indicating a possible different route for crystallization at lower protein supersaturations. Based on this interpretation, we have changed growth conditions, thus altering growth rates along the different directions and obtaining a more anisotropic crystal shape. Supported egg phosphatidylcholine (EPC) and dimyristoylfosfatidylcholine (DMPC) were formed on mica using the vesicle fusion method. Topography and phase images were acquired on the lipid membrane in the absence or presence of DBC. The AFM images show irregularly distributed and sized EPC domains on mica. On the other hand, DMPC formation presents extensive bilayer (on mica) with multi-bilayer domains. For EPC bilayers, we have observed a progressive decrease in size of the original EPC domains with increasing DBC concentration. At higher concentrations (5mM), the DBC effect was more drastic, causing disruption of the EPC bilayer. In the DMPC bilayer case, at 5mM DBC concentration, we observed a progressive disruption of the domains with time, but more slowly than in the EPC case. In both cases, phase images show the formation of small structures on the bilayer surface, indicating changes in the elastic properties of the bilayers when DBC is present. Adsorption kinetics and elasticity measurements of EPC and DMPC monolayers in the presence of DBC by pendant drop method confirm this hypothesis. A discussion of possible mechanisms for these effects is presented. / Mestrado / Física / Mestre em Física

Orientadores: Eneida de Paula, Daniele Ribeiro de Araújo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T00:52:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_RaqueldeMelo_D.pdf: 5424104 bytes, checksum: a7f0888c7fb32138387068083d5bf74f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) e carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) têm sido utilizados com sucesso como sistemas de liberação modificada. O anestésico local dibucaína (DBC) foi encapsulado em SLN e NLC objetivando aplicação tópica, para melhora de sua disponibilidade redução de efeitos adversos. As nanopartículas lipídicas foram preparadas pelas técnicas de sonicação (Son) ou homogeinização à alta pressão (HP), sendo utilizados palmitato de cetila (CP) ou miristato de miristila (MM) como matrizes lipídicas sólidas, acrescidos (NLC) ou não (SLN) de uma mistura de triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico; poloxamer 188 foi usado como tensoativo. A DBC encapsulada foi quantificada por metodologia validada por cromatografia líquida de alta eficiência. As análises físico-químicas compreenderam diâmetro médio, potencial zeta, distribuição de tamanhos e morfologia das nanopartículas, percentual de encapsulação além de medidas de calorimetria exploratória de varredura (DSC), espectroscopia de infravermelho (FTIR), ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e difração de raios X à baixo ângulo (SAXS). Medidas in vitro do perfil de liberação do fármaco, da estimativa de fluxo, deformação e elasticidade das partículas através de membranas artificiais e de toxicidade em cultura de células (fibloblastos 3T3 e queratinócitos HaCat) foram feitas. A estabilidade das amostras foi avaliada em função do tempo e testes de antinocicepção (tail flick, em ratos Wistar) foram usados para avaliar a atividade terapêutica in vivo. O diâmetro médio das partículas de SLN e NLC produzidas foi similar (ca. 200nm). A estabilidade física das nanopartículas foi satisfatória por até 240 dias de armazenamento a 4 ºC, principalmente para NLCMM/HP com e sem DBC, sugerindo que a metodologia de HP produz partículas mais estáveis. Todas as formulações apresentaram eficiência de encapsulação maior que 70%, sendo que NLCMMDBC/HP apresentou a maior encapsulação (90,54 ± 0,95%). Medidas de FTIR e DSC revelaram a DBC molecularmente dispersa na matriz lipídica das nanopartículas. Quanto à organização molecular das SLN e NLC, resultados de SAXS indicaram a existência de arranjos lipídicos lamelares no interior das SLN, não alterados pela adição da DBC; as medidas de RPE com marcadores de spin doxil-estearato revelaram espectros compatíveis com bicamadas, com maior organização molecular dos lipídios das SLN e NLC, após inserção da DBC. Ensaios in vitro confirmaram a liberação modificada da dibucaína associada às partículas, governada por difusão de Fick. Tanto a elasticidade quanto o fluxo das partículas in vitro apresentaram baixos valores evidenciando deposição das mesmas nas membranas com poros de 30 nm. A citotoxicidade intrínsica da DBC sobre ambos os tipos celulares foi reduzida após encapsulação nas SLN e NLC. O efeito analgésico in vivo da DBC a 0,05% aplicada topicamente (dispersa em gel de carbopol) aumentou significativamente após encapsulação nas formulações, em particular para SLNCPDBC liofilizada com o crioprotetor maltose. Assim, formulações de dibucaína em SLN ou NLC, preparadas com MM ou CP mostraram-se promissoras como bases para produtos farmacêuticos de liberação modificada, para anestesia dérmica / Abstract: Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC), intended for topical application, were successfully prepared as sustained release systems for the encapsulation of the local anesthetic dibucaine (DBC), aiming to reduce its toxic effects and to improve its availability. The particles were prepared by two differents procedures: sonication (Son) or high pressure homogenization (HP), employing either cetyl palmitate (CP) or myristyl myristate (MM) as the solid lipid matrix, in the presence (NLC) or absence (SLN) of a mixture of capric and caprylic acids; poloxamer 188 was used as surfactant. DBC was quantified through a validated HPLC procedure. Physico-chemical analysis of the nanoparticles included measurements of size distribution, zeta potential, morphology, DBC encapsulation efficiency, as well as exploratory scanning calorimetry (DSC), infrared spectroscopy (FTIR), electron paramagnetic resonance (EPR) and small angle X-ray scattering (SAXS) tests. In vitro analysis of the release profile, flow and elasticity of the particles were performed through artificial membranes while toxicity was tested in 3T3 fibroblasts and HaCaT keratinocytes in culture. Stability of the formulations as a function of time was also measured. The therapeutic activity of the formulations was determined using antinociception tests (tail flick) in Wistar rats. SLN and NLC produced by both methodologies were similar (~200 nm), but HP produced more stable nanoparticles. The physical stability of the nanoparticles was satisfactory during a storage period of 240 days, especially for NLCMM/HP with or without DBC. All formulations showed encapsulation efficiencies higher than 70%, the greatest being assigned for NLCMMDBC/HP (90.54 ± 0.95%). FTIR and DSC revealed that DBC was molecularly dispersed in the lipid matrix of the nanoparticles. As for the SLN and NLC molecular packing, SAXS diffractrograms indicated the existence of lamellar repeats in SLN core region, which were not disturbed by the addition of DBC while EPR data with doxyl stearate probes revealed spectra compatible with bilayers, with higher molecular order in the presence of DBC. In vitro assays confirmed the prolonged release of dibucaine from the nanoparticles, by Fickian diffusion. Nanoparticles's elasticity and flow were low showing deposition on the surface of 30 nm pore membranes. The intrinsic cytotoxicity of DBC against both cell types was decreased, when encapsulated in SLN and NLC. The in vivo analgesic effect of 0.05% DBC topically applied (dispersed in carbopol gel) was significantly prolonged in the nanoparticle formulations, largely for SLNCPDBC lyophilized with maltosis as crioprotector. In conclusion, dibucaine formulations in SLN or NLC prepared with MM or CP are promising for the development of pharmaceutical products intended for prolonged dermal anesthesia / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular