京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24515号 / 医博第4957号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 森信 暁雄, 教授 竹内 理, 教授 濵﨑 洋子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Les cellules Natural Killer (NK), un sous-type de lymphocytes, sont cruciales dans l’immunité innée de par leur cytotoxicité directe envers les tumeurs, les cellules infectées et les cellules stressées. Elles contribuent également à l’orchestration de la réponse immunitaire adaptative de par leur capacité à produire des cytokines immunorégulatrices. Pour développer ces fonctions effectrices, les cellules NK requièrent l’intégration d’une multitude de signaux. De là, les cellules NK matures (mNK) sont considérées comme appartenant à quatre sous-types conséquents et concordants avec la polarisation vers la prolifération, la production de cytokines ou les propriétés cytotoxiques. Dans certaines maladies auto-immunes, tel le diabète de type 1 (T1D), un bloc dans leur maturation, et conséquemment des défauts en nombre et en fonctions, peut être observé. Ainsi, afin de découvrir la régulation génétique derrière la proportion et la maturation des cellules NK, des études de liaison génétique ont été produites sur des souris F2 (B10.BR x NOD.H2k) et F2.Rag (B6.Rag1-/- x NOD.Rag1-/-), où le fond génétique NOD est un modèle de T1D. Ces analyses ont révélé des locus potentiellement impliqués dans la régulation de la proportion, des nombres absolus ainsi que dans la maturation fonctionnelle des cellules mNK. Les chromosomes 8, 9 et 17 ont été liés à la proportion des cellules mNK tandis que les chromosomes 2, 4, 7, 10, 11 et 18 ont été liés aux sous-types fonctionnels de ces mêmes cellules. De là, nous avons validé l’influence du locus du chromosome 9 sur la proportion des cellules mNK en générant des souris sous-congéniques avec des insertions de segment génétique B10.BR dans des souris de fond génétique NOD. La proportion et le nombre absolu de cellules mNK ont ensuite été analysés par cytométrie en flux et comparés à ceux de souris contrôles. Pour la maturation fonctionnelle, nous avons retenus certains gènes candidats, et régulateurs associés, liés à un ou plusieurs sous-types de mNK, dont Tbx21, Zeb2, c-Myb, Trp53 et Pmaip1. Par association de voies de signalisation, nous sommes également allés vérifier certaines protéines associées, dont Bim et Eomesodermin. Nous avons alors validé leur implication par l’utilisation de modèles murins knock-out, qPCR, essais de prolifération et d’apoptose. Enfin, nos résultats supportent un rôle pour le locus du chromosome 9 dans la régulation de la proportion de cellules mNK ainsi qu’un rôle pour Trp53, Bim et Pmaip1 dans la maturation fonctionnelle de celles-ci. Nos études révèlent donc de nouveaux gènes candidats potentiels dans la régulation des cellules NK, dont les mécanismes pourront être approfondis dans la perspective de développement de thérapies cellulaires et génétiques dans le combat contre les cancers et les infections chroniques. / Natural Killer (NK) cells, a subset of lymphocytes, are crucial in innate immunity due to their direct cytotoxicity towards tumors, viral infected cells and stressed cells. NK cells also contribute to the orchestration of the adaptive response by their ability to produce immunoregulatory cytokines. To develop those effector functions, NK cells require the integration of multiple signals. As of now, mature NK cells (mNK) can be separated into a four-stage model of functional maturation that concords with a polarization either toward proliferation and cytokine production or cytotoxic functional properties. In autoimmune diseases, like type 1 diabetes (T1D), a block in their maturation, and consequently an impaired functionality and diminished numbers, can be observed. Thus, in order to uncover the genetic regulation behind the proportion and functional maturation of NK cells, a linkage analysis was performed by our lab on F2 (B10.BR x NOD.H2k) and F2.Rag (B6.Rag1-/- x NOD.Rag1-/- intercross) mice, where the NOD genetic background is a model of T1D. This analysis revealed loci that were potentially involved in the regulation of mNK cells proportion, absolute numbers or functional maturation. Loci on chromosomes 8, 9 and 17 were linked to the proportion of mNK cells while loci on chromosomes 2, 4, 7, 10, 11 and 18 were linked to different subsets of functional mNK cells. Hence, we validated the influence of the chromosome 9 locus on the proportion of mNK cells by generating congenic sub-strains of mice with insertion of B10.BR genetic segments and NOD genetic background. The proportion and absolute numbers of mNK cells were assessed by flow cytometry and compared to those of wild-type mice. Regarding the functional maturation of mNK cells, we considered potential candidate genes, and their upstream regulators, that were linked to one or more mNK subsets, namely Tbx21, Zeb2, Myb, Trp53 and Pmaip1. From those, we also looked further their associated pathway with proteins such as Bim and Eomesodermin. We proceeded to the in vivo validation of their implication by qPCR, proliferation and apoptosis assays and the use of knock-out mice. Indeed, our results support a role for a locus on chromosome 9 in the regulation of mNK cells proportion and for Trp53, Bim and Pmaip1 in NK cell functional maturation. As such, our study has revealed new candidate genes in NK cell regulation. Further explorations of the mechanisms by which those genes act could lead to the development of cellular and genetic therapies for cancers and chronic infections.