Η θανατηφόρος δράση του βακτηρίου του άνθρακα (Bacillus anthracis), στο οποίο οφείλεται η καλούμενη ως νόσος του άνθρακα, εντοπίζεται στη συνεργό δράση τριών εκλυόμενων τοξινών του και ειδικότερα στην πρωτεολυτική δράση του θανατηφόρου παράγοντα (anthrax Lethal Factor, LF). Ο LF είναι μία μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου και ισχυρή τοξίνη, η οποία απελευθερώνεται στον οργανισμό στα πρώτα στάδια προσβολής του ατόμου από το βακτήριο. Το ενεργό/καταλυτικό κέντρο του αναγνωρίζει και υδρολύει με εξαιρετική εξειδίκευση πεπτιδικά υποστρώματα ΜΚΚ κινασών, αναστέλλοντας τις διαδικασίες μεταγωγής σήματος στα κύτταρα του μολυσμένου ξενιστή επιφέροντας το θάνατό του. Από την άλλη, η εξειδικευμένη πρωτεολυτική ικανότητα του LF έναντι αυτών των κινασών, οι οποίες πρόσφατα συσχετίστηκαν με ανάπτυξη καρκινικών όγκων, ενδέχεται να αποτελέσει μια καινοτόμο θεραπευτική οδό για την αντιμετώπιση καρκινικών όγκων εν τη γενέση τους. Ωστόσο, ο μηχανισμός της αλληλεπίδρασης σε μοριακό επίπεδο και της πρωτεολυτικής διάσπασης των υποστρωμάτων του LF παραμένει μέχρι και σήμερα αδιευκρίνιστος και συνεπώς χρήζει ιδιαίτερης μελέτης. Προς αυτή την κατεύθυνση εστιάστηκε το ενδιαφέρον της διατριβής έχοντας ως πρωτογενείς στόχους την in silico μελέτη της αλληλεπίδρασης, σε μοριακό επίπεδο, του καταλυτικού κέντρου του LF με τα υποστρώματα των ΜΚΚ κινασών που υδρολύει, και την μελέτη μέσω Φασματοσκοπίας NMR της δομής και δυναμικής του ενεργού κέντρου του LF σε ελεύθερη μορφή, το οποίο ευρίσκεται στο C-τελικό άκρο του. Με την εφαρμογή τεχνικών προσομοίωσης πρόσδεσης και μοριακής δυναμικής πραγματοποιήθηκε in silico μελέτη των συμπλόκων LF-υποστρώματα, και προσδιορίστηκε ένα ευρύ φάσμα αλληλεπιδράσεων, όχι μόνο γύρω από το μεταλλικό/καταλυτικό κέντρο αλλά και σε απόσταση 20 Å στην περιοχή δέσμευσης του Zn2+, υποδεικνύοντας έτσι τους δομικούς παράγοντες που πιθανόν καθορίζουν το είδος της αλληλεπίδρασής ενζύμου με τις κινάσες που υδρολύει, παρέχοντας έτσι σημαντικές πληροφορίες για τον σχεδιασμό και την αναζήτηση βιοδραστικών μορίων με φαρμακευτικό ενδιαφέρον έναντι στον LF. Τα δεδομένα αυτά μπορούν επίσης να αξιοποιηθούν σε μελέτες δομής-δράσης με σημειακές και/ή πολλαπλές μεταλλάξεις. Με την χρήση φασματοσκοπίας NMR, πραγματοποιήθηκε μελέτη της δομής και δυναμικής του ενεργού κέντρου του LF σε ελεύθερη μορφή (apoLF672-776). Η επίλυση των τρισδιάστατων NMR δομών του apoLF672-776 έδωσαν μια εξαιρετικά σαφή εικόνα για τη δομή του ενεργού κέντρου του LF, το οποίο βρίσκεται σε συμφωνία με τις υπάρχουσες κρυσταλλικές δομές. Τα συγκεκριμένα ΝΜR δεδομένα μπορούν να αξιοποιηθούν σε μελέτες με NMR υπό το καθεστώς αλληλεπίδρασης του LF με τα πεπτιδικά υποστρώματά του και χαρακτηρισμό της δυναμικής της αλληλεπίδρασης, όπως επίσης και τον υπολογισμό της συγγένειας δέσμευσής τους. / The anthrax toxin of the bacterium Bacillus anthracis consists of three distinct proteins, one of which is the anthrax lethal factor (LF). LF is a gluzincin Zn-dependent, highly specific metalloprotease with a molecular mass of ~90 kDa that cleaves most isoforms of the family of mitogen-activated protein kinase kinases (MEKs/MKKs) close to their amino termini, resulting in the inhibition of one or more signaling pathways. Previous studies on the crystal structures of uncomplexed LF and LF complexed with the substrate MEK2 or a MKK-based synthetic peptide provided structure-activity correlations and the basis for the rational design of efficient inhibitors. However, in the crystallographic structures, the substrate peptide was not properly oriented in the active site due to the absence of the catalytic zinc atom. The primary target of the thesis was to examine in silico the LF-MEK/MKK interaction along the catalytic channel up to a distance of 20 Å from the zinc atom, using docking and molecular dynamics protocols. This residue-specific view of the enzyme-substrate interaction provides valuable information about: (i) the substrate selectivity of LF and its inactivation of MEKs/MKKs, (an issue highly important not only to anthrax infection, but also to the pathogenesis of cancer), and (ii) the discovery of new, previously unexploited, hot-spots of the LF catalytic channel that are important in the enzyme/substrate binding and interaction. Given the importance of the interaction between LF and substrate for the development of anti-anthrax agents as well as the potential treatment of nascent tumours, the analysis of the structure and dynamic properties of the LF catalytic site are essential to elucidate its enzymatic properties. The thesis interest was oriented then to the solution structure of the catalytic domain of apo LF and present data on its dynamics. The solution nuclear magnetic resonance (NMR) structure and mobility studies of the catalytic domain of apoLF672-776 reveals that the conformation of the C-terminal construct of the LF catalytic domain and the orientation of the six helical motifs are remarkably similar to the native structure, indicating the LF polypeptides catalytic site as reliable models of the enzyme active centre.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-05T14:58:52Z No. of bitstreams: 1 TES_RENATA_DE_PARIS_COMPLETO.pdf: 8873897 bytes, checksum: 43b2a883518fc9ce39978e816042ab5f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:58:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_RENATA_DE_PARIS_COMPLETO.pdf: 8873897 bytes, checksum: 43b2a883518fc9ce39978e816042ab5f (MD5) Previous issue date: 2016-10-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / O uso de conforma??es obtidas por trajet?rias da din?mica molecular nos experimentos de docagem molecular ? a abordagem mais precisa para simular o comportamento de receptores e ligantes em ambientes moleculares. Entretanto, tais simula??es exigem alto custo computacional e a sua completa execu??o pode se tornar uma tarefa impratic?vel devido ao vasto n?mero de informa??es estruturais consideradas para representar a expl?cita flexibilidade de receptores. Al?m disso, o problema ? ainda mais desafiante quando deseja-se utilizar modelos de receptores totalmente flex?veis (Fully-Flexible Receptor - FFR) para realizar a triagem virtual em bibliotecas de ligantes. Este estudo apresenta um m?todo inovador para otimizar a triagem virtual baseada em docagem molecular de modelos FFR por meio da redu??o do n?mero de experimentos de docagem e, da invoca??o escalar de workflows de docagem para m?quinas virtuais de plataformas em nuvem. Para esse prop?sito, o workflow cient?fico basedo em nuvem, chamado e-FReDock, foi desenvolvido para acelerar as simula??es da docagem molecular em larga escala. e-FReDock ? baseado em um m?todo seletivo sem param?tros para executar experimentos de docagem ensemble com m?ltiplos ligantes. Como dados de entrada do e-FReDock, aplicou-se seis m?todos de agrupamento para particionar conforma??es com diferentes caracter?sticas estruturais no s?tio de liga??o da cavidade do substrato do receptor, visando identificar grupos de conforma??es favor?veis a interagir com espec?ficos ligantes durante os experimentos de docagem. Os resultados mostram o elevado n?vel de qualidade obtido pelos modelos de receptores totalmente flex?veis reduzidos (Reduced Fully-Flexible Receptor - RFFR) ao final dos experimentos em dois conjuntos de an?lises. O primeiro mostra que e-FReDock ? capaz de preservar a qualidade do modelo FFR entre 84,00% e 94,00%, enquanto a sua dimensionalidade reduz em uma m?dia de 49,68%. O segundo relata que os modelos RFFR resultantes s?o capazes de melhorar os resultados de docagem molecular em 97,00% dos ligantes testados quando comparados com a vers?o r?gida do modelo FFR. / The use of conformations obtained from molecular dynamics trajectories in the molecular docking experiments is the most accurate approach to simulate the behavior of receptors and ligands in molecular environments. However, such simulations are computationally expensive and their execution may become an infeasible task due to the large number of structural information, typically considered to represent the explicit flexibility of receptors. In addition, the computational demand increases when Fully-Flexible Receptor (FFR) models are routinely applied for screening of large compounds libraries. This study presents a novel method to optimize docking-based virtual screening of FFR models by reducing the size of FFR models at docking runtime, and scaling docking workflow invocations out onto virtual machines from cloud platforms. For this purpose, we developed e-FReDock, a cloud-based scientific workflow that assists in faster high-throughput docking simulations of flexible receptors and ligands. e-FReDock is based on a free-parameter selective method to perform ensemble docking experiments with multiple ligands from a clustered FFR model. The e-FReDock input data was generated by applying six clustering methods for partitioning conformations with different features in their substrate-binding cavities, aiming at identifying groups of snapshots with favorable interactions for specific ligands at docking runtime. Experimental results show the high quality Reduced Fully-Flexible Receptor (RFFR) models achieved by e-FReDock in two distinct sets of analyses. The first analysis shows that e-FReDock is able to preserve the quality of the FFR model between 84.00% and 94.00%, while its dimensionality reduces on average 49.68%. The second analysis reports that resulting RFFR models are able to reach better docking results than those obtained from the rigid version of the FFR model in 97.00% of the ligands tested.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από τη δέσμευση ενός προσδέτη (LGICs) και αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες. Κάθε μονομερής υπομονάδα αποτελείται από μία Ν-τελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Στην ΕΚΠ βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys-θηλιά της υπερ-οικογένειας, καθώς και οι θέσεις πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών του υποδοχέα. Οι γνώσεις μας γύρω από τη δομή των nAChRs προέρχονται κυρίως από κρυσταλλογραφικές δομές ομολόγων πρωτεϊνών δέσμευσης της ACh (AChBP) μαλακίων, από μια δομή του nAChR από ιχθείς του γένους Torpedo που προέρχεται από ηλεκτρονική μικροσκοπία, από την κρυσταλλογραφική δομή της α1-ΕΚΠ ποντικού σε σύμπλοκο με α-μπουγκαροτοξίνη (α-Btx) και από κρυσταλλογραφικές δομές δύο προκαρυωτικών LGICs. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που πραγματοποιήθηκε με τα παραπάνω επιτεύγματα, ακόμη δεν έχει επιλυθεί πειραματικά η δομή ανθρώπινου υποδοχέα. Επίσης λίγα είναι γνωστά για την επίδραση της γλυκοζυλίωσης των ΕΚΠ στη λειτουργία του nAChR. Χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου α1-ΕΚΠ ποντικού/α-Btx δημιουργήθηκαν υπολογιστικά μοντέλα της ανθρώπινης α1-ΕΚΠ προσδεμένης στις τοξίνες α-μπουγκαροτοξίνη (α-Btx), α-κομπρατοξίνη (α-Cbtx), α-κωνοτοξίνη (α-Ctx) ImI και α-κωνοτοξίνη GI. Στα σύμπλοκα με α-Btx και α-Cbtx προστέθηκε η υδατανθρακική αλυσίδα, συνδεδεμένη με το κατάλοιπο Asn141, που συγκρυσταλλώθηκε μαζί με την α1-ΕΚΠ ποντικού. Για να μελετηθεί η δυναμική συμπεριφορά της αλληλεπίδρασης υποδοχέα-τοξίνης καθώς και η συνεισφορά των σακχάρων σε αυτήν πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής σε υδατικό περιβάλλον. Με τη χρήση υπολογιστικών εργαλείων για τη μελέτη των συμπλόκων προσδιορίστηκαν σε ατομικό επίπεδο οι αλληλεπιδράσεις που καθοδηγούν την πρόσδεση τοξινών στην α1-ΕΚΠ. Βρέθηκε ότι η υδατανθρακική αλυσίδα συμμετέχει δυναμικά στη δέσμευση της τοξίνης στον υποδοχέα. Τα σάκχαρα συγκλίνουν προς την προσδεμένη τοξίνη στηριζόμενα στα κατάλοιπα Ser187 και Trp184 της α1 υπομονάδας. Η τοξίνη επίσης μετακινείται φέρνοντας τη θηλιά Ι σε επαφή με τα σάκχαρα. Αναγνωρίστηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις των σακχάρων με τα τοξινικά κατάλοιπα Thr6, Ser9, και Th15 της α-Btx και Thr6 και Pro7 της α-Cbtx. Επίσης επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη μιας υδρόφιλης κοιλότητας στο εσωτερικό του υδρόφοβου πυρήνα της α1-ΕΚΠ, η οποία πιθανόν εμπλέκεται στο άνοιγμα του ιοντικού καναλιού του nAChR. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν σημαντικά δεδομένα για την κατανόηση της επίδρασης της υδατανθρακικής αλυσίδας στη λειτουργία του υποδοχέα, η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί στην αντιμετώπιση των πολλών παθολογικών καταστάσεων στις οποίες εμπλέκονται οι nAChRs. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of ligand-gated ion channels (LGICs). LGICs form homo- or hetero-pentamers of related subunits, and each of them consists of a N-terminal extracellular ligand-binding domain (ECD), four transmembrane α-helixes and an intracellular region. The characteristic Cys-loop of the superfamily is found in the ECD of each subunit. The ECD also contains binding sites for agonists and competitive antagonists. Our knowledge regarding the nAChR structure mainly derives from the X-ray crystal structures of the molluscan ACh-binding proteins (AChBPs), the electron microscopy structure of the Torpedo nAChR, the X-ray crystal structure of the mouse nAChR α1-ECD bound to α-bungarotoxin (α-Btx), and the X-ray crystal structures of two prokaryotic LGICs. Despite the progress made by these achievements, the determination of any human nAChR structure has not yet been accomplished. Furthermore, the effect of glycosylation on nAChR function has not yet been explored. Based on the crystal structure of the extracellular domain of the mouse nAChR α1 subunit bound to α-Btx we have generated in silico models of the human nAChR α1-ECD bound to the toxins α-bungarotoxin (α-Btx), α-cobratoxin (α-Cbtx), α-conotoxin (α-Ctx) ImI and α-conotoxin GI. In the case of the α1-ECD/α-Btx and α-Cbtx complexes, a Asn141-linked carbohydrate chain was modeled, its coordinates taken from the crystal structure of the mouse α1-ECD. To gain further insight into the structural role of glycosylation molecular dynamics (MD) simulations were carried out in explicit solvent so as to compare the conformational dynamics of the binding interface between nAChR α1 and the two toxins. The use of computational methods allowed the monitoring of the interactions that govern toxin binding. The MD simulations revealed the strengthening of the receptor-toxin interaction in the presence of the carbohydrate chain. A shift in the position of the sugars towards the bound toxin was observed. Residues Ser187 and Trp184 of nAChR act as critical anchor points for the stabilization of the sugar chain in a close position to the toxin. Toxin Finger I shifts closer to the mannoses, forming important toxin-sugar interactions that implicate residues Thr6, Ser9, and Thr15 of α-Btx, as well as Thr6 and Pro7 of α-Cbtx. Additionally the MD simulations of the human α1 ECD–toxin complexes confirmed the possible accommodation of two water molecules into a hydration cavity inside the hydrophobic core of the subunit, which may contribute to the gating mechanism of the receptor. These findings provide additional structural data that are intended to inspire biophysical studies on the functional role of glycosylation in the gating mechanism of nAChR and also guide the development of novel therapeutic agents for the treatment of nAChR-associated diseases.