Os elementos de transposicão (TEs) são sequências genéticas móveis. Sua capacidade mutagênica faz deles uma importante fonte de variabilidade nos genomas. Outro importante papel dos TEs na evolução dos genomas é o de doadores de domínios protéicos na formação de novos genes. 276 clones de cDNA homólogos a TEs foram previamente identificados no banco de dados do SUCEST (projeto de sequenciamento de etiquetas expressas de cana-de-acúcar). Neste trabalho nós realizamos o sequenciamento completo de 156 destes clones e a classificação e caracterização de suas sequências comparando-as com bancos de dados. Foram identificadas 9 diferentes famílias de transposons e 11 diferentes famílias de retrotransposons. As famílias mais representadas entre os transposons foram MuDr e hAT (que engloba os elementos do tipo Ac e Tam3), para os quais foram identificados 43 e 32 clones de cDNA, respectivamente. Entre os retrotransposons, a família mais representada foi Hopscotch, apresentando 25 clones de cDNA. Após esta análise global, o foco das investigações voltou-se para os cDNAs do tipo hAT. Uma análise comparativa destes cDNAs revelou que as sequências homólogas a hAT estão distribuídas em dois grupos. O grupo I, é composto por sequências com alta conservação no nível de nucleotídeos, está presente no genoma de todas as gramíneas analisadas (híbridos e parentais da cana-de-acúcar, milho e arroz) com um baixo número de cópias, teve a sua expressão detectada em folhas, raízes e mais intensamente em calos cana. Além disso, apresenta alta similaridade de sequências com transposases domesticadas descritas na literatura. O grupo II, por sua vez, é composto por sequências mais heterogêneas, que apresentam similaridade com os transposons originais que constituem a superfamília hAT: hobo (de Drosophila melanogaster), Ac (de Zea mays) e Tam3 (de Antirrhinum majus). Sua distribuição é restrita ao genoma de Saccharum, com um número de cópias maior que o grupo I. Um ensaio de PCR-Inversa identificou terminações inversas repetidas (TIRs) para o cDNA TE221 do grupo II. A partir de iniciadores desenhados sobre estas TIRs foi possível recuperar dois elementos, de 3,5kb e 4,2kb, respectivamente, e um MITE de 250 pb, todos homólogos a hAT. Este resultado demonstrou que a estratégia utilizada para recuperar elementos do genoma da cana-de-açúcar a partir do cDNA TE221 mostrou-se eficiente. Homólogos aos grupos I e II de cana-de-acúcar foram identificados em bancos de dados de milho, arroz e arabidopsis. Estes dados sugerem que a separação dos dois grupos ocorreu antes da divergência entre as classes Monocotiledonea e Eudicotiledonea. Com base nos resultados aqui apresentados sugerimos que um transposon ancestral do tipo hAT, presente nas angiospermas anteriormente à separação de Monocotiledonea e Eudicotiledonea, teve sua transposase capturada na formação de um gene com função celular. A partir do evento da domesticação, estas transposases seguiram dois caminhos evolutivos distintos, um como gene funcional e outro como um transposon tradicional. Estas duas formas de transposase do tipo hAT podem ser encontradas no genoma da cana-de-acúcar, representadas pelos elementos dos grupos I e II, respectivamente. / Transposable elements (TEs) are mobile genetic sequences. Their mutagenic capacity makes them important sources of variation in the genomes. These elements have another important evolutionary role as donors of functional protein domains in the formation of new genes. 276 cDNA clones homologous to TEs were previously identified in the Brazilian Sugarcane Expressed Sequence Tag Project (SUCEST) databases. In this work, we have obtained the full sequences of 156 for these clones. These sequences were compared with Genbank database. We have identified 9 families of transposons and 11 families of retrotransposons. The most representative families found amongst the transposons were MuDr and hAT (wich encompass Ac and Tam3), with 43 and 32 cDNAs, respectively. Amongst the retrotransposons, the most representative family was Hopscotch, with 25 cDNAs. After this global analysis, we have focused our investigation in the hAT-like cDNAs. A comparative analysis of these cDNAs has revealed a profile of two distinct groups. Group I is composed of sequences with high conservation at nucleotide level, it is present in the genome of all grasses analysed (hybrids and parentals of sugarcane, maize and rice) with low copy number, it is expressed in leaves and roots of sugarcane, and more intensely in callus. In addition, group I sequences have clustered with domesticated transposases. The group II is composed of more heterogeneous sequences similar with the original elements that constitute the hAT superfamily: hobo (from Drosophilla melanogaster), Ac (from Zea mays) and Tam3 (from Antirrhinum majus). This group was shown to be restricted to the genome of Saccharum, with higher copy number than group one. Inverse-PCR assays has identified terminal inverted repeats (TIRs) to the cDNA TE221 from group II. Primers based on the sequences of the TIRs allowed us to recover three elements hAT-like from sugarcane’s genomic DNA: one of 3,5kb and another of 4,2kb, and a MITE of 250 bp. These results corroborate the strategy applied in order to recover elements from the sugarcane´s genome. Sequences homologous to both sugarcane group I and group II were found also in maize and rice, as well as in arabidopsis databases. These data suggest that the divergence of the two groups occured before the separation between the classes Monocotiledonea and Eudicotiledonea. Based on our results, we suggest the existence of an ancestral transposon hAT-like, present in angiosperms before the separation between Monocotiledonea and Eudicotiledonea, of which the transposase was captured to compose a new gene with some cellular function. Since the domestication event, these transposases followed distinct evolutive pathways, one as a regular gene and another as a bona fide transposon. These two forms of hAT-like transposases could be found in the sugarcane’s genome, represented by the elements from groups I and II, respectively.

Os elementos de transposicão (TEs) são sequências genéticas móveis. Sua capacidade mutagênica faz deles uma importante fonte de variabilidade nos genomas. Outro importante papel dos TEs na evolução dos genomas é o de doadores de domínios protéicos na formação de novos genes. 276 clones de cDNA homólogos a TEs foram previamente identificados no banco de dados do SUCEST (projeto de sequenciamento de etiquetas expressas de cana-de-acúcar). Neste trabalho nós realizamos o sequenciamento completo de 156 destes clones e a classificação e caracterização de suas sequências comparando-as com bancos de dados. Foram identificadas 9 diferentes famílias de transposons e 11 diferentes famílias de retrotransposons. As famílias mais representadas entre os transposons foram MuDr e hAT (que engloba os elementos do tipo Ac e Tam3), para os quais foram identificados 43 e 32 clones de cDNA, respectivamente. Entre os retrotransposons, a família mais representada foi Hopscotch, apresentando 25 clones de cDNA. Após esta análise global, o foco das investigações voltou-se para os cDNAs do tipo hAT. Uma análise comparativa destes cDNAs revelou que as sequências homólogas a hAT estão distribuídas em dois grupos. O grupo I, é composto por sequências com alta conservação no nível de nucleotídeos, está presente no genoma de todas as gramíneas analisadas (híbridos e parentais da cana-de-acúcar, milho e arroz) com um baixo número de cópias, teve a sua expressão detectada em folhas, raízes e mais intensamente em calos cana. Além disso, apresenta alta similaridade de sequências com transposases domesticadas descritas na literatura. O grupo II, por sua vez, é composto por sequências mais heterogêneas, que apresentam similaridade com os transposons originais que constituem a superfamília hAT: hobo (de Drosophila melanogaster), Ac (de Zea mays) e Tam3 (de Antirrhinum majus). Sua distribuição é restrita ao genoma de Saccharum, com um número de cópias maior que o grupo I. Um ensaio de PCR-Inversa identificou terminações inversas repetidas (TIRs) para o cDNA TE221 do grupo II. A partir de iniciadores desenhados sobre estas TIRs foi possível recuperar dois elementos, de 3,5kb e 4,2kb, respectivamente, e um MITE de 250 pb, todos homólogos a hAT. Este resultado demonstrou que a estratégia utilizada para recuperar elementos do genoma da cana-de-açúcar a partir do cDNA TE221 mostrou-se eficiente. Homólogos aos grupos I e II de cana-de-acúcar foram identificados em bancos de dados de milho, arroz e arabidopsis. Estes dados sugerem que a separação dos dois grupos ocorreu antes da divergência entre as classes Monocotiledonea e Eudicotiledonea. Com base nos resultados aqui apresentados sugerimos que um transposon ancestral do tipo hAT, presente nas angiospermas anteriormente à separação de Monocotiledonea e Eudicotiledonea, teve sua transposase capturada na formação de um gene com função celular. A partir do evento da domesticação, estas transposases seguiram dois caminhos evolutivos distintos, um como gene funcional e outro como um transposon tradicional. Estas duas formas de transposase do tipo hAT podem ser encontradas no genoma da cana-de-acúcar, representadas pelos elementos dos grupos I e II, respectivamente. / Transposable elements (TEs) are mobile genetic sequences. Their mutagenic capacity makes them important sources of variation in the genomes. These elements have another important evolutionary role as donors of functional protein domains in the formation of new genes. 276 cDNA clones homologous to TEs were previously identified in the Brazilian Sugarcane Expressed Sequence Tag Project (SUCEST) databases. In this work, we have obtained the full sequences of 156 for these clones. These sequences were compared with Genbank database. We have identified 9 families of transposons and 11 families of retrotransposons. The most representative families found amongst the transposons were MuDr and hAT (wich encompass Ac and Tam3), with 43 and 32 cDNAs, respectively. Amongst the retrotransposons, the most representative family was Hopscotch, with 25 cDNAs. After this global analysis, we have focused our investigation in the hAT-like cDNAs. A comparative analysis of these cDNAs has revealed a profile of two distinct groups. Group I is composed of sequences with high conservation at nucleotide level, it is present in the genome of all grasses analysed (hybrids and parentals of sugarcane, maize and rice) with low copy number, it is expressed in leaves and roots of sugarcane, and more intensely in callus. In addition, group I sequences have clustered with domesticated transposases. The group II is composed of more heterogeneous sequences similar with the original elements that constitute the hAT superfamily: hobo (from Drosophilla melanogaster), Ac (from Zea mays) and Tam3 (from Antirrhinum majus). This group was shown to be restricted to the genome of Saccharum, with higher copy number than group one. Inverse-PCR assays has identified terminal inverted repeats (TIRs) to the cDNA TE221 from group II. Primers based on the sequences of the TIRs allowed us to recover three elements hAT-like from sugarcane’s genomic DNA: one of 3,5kb and another of 4,2kb, and a MITE of 250 bp. These results corroborate the strategy applied in order to recover elements from the sugarcane´s genome. Sequences homologous to both sugarcane group I and group II were found also in maize and rice, as well as in arabidopsis databases. These data suggest that the divergence of the two groups occured before the separation between the classes Monocotiledonea and Eudicotiledonea. Based on our results, we suggest the existence of an ancestral transposon hAT-like, present in angiosperms before the separation between Monocotiledonea and Eudicotiledonea, of which the transposase was captured to compose a new gene with some cellular function. Since the domestication event, these transposases followed distinct evolutive pathways, one as a regular gene and another as a bona fide transposon. These two forms of hAT-like transposases could be found in the sugarcane’s genome, represented by the elements from groups I and II, respectively.

L’élimination programmée d’ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l’introduction de cassures double brin (CDB) de l’ADN et la préservation de l’intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l’introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l’excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l’élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L’implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l’excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n’y a pas de jonctions d’excision formées et les extrémités cassées s’accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L’hypothèse d’une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l’utilisation de microhomologie, a été émise. C’est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d’extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l’ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d’un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l’introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome. / Programmed elimination of germline specific DNA has been described in several eukaryotic organisms. These rearrangements are initiated through introduction of DNA double strand breaks (DSB). To ensure genome integrity, efficient repair is needed. In Paramecium tetraurelia, the genome is widely rearranged during development of a new somatic nucleus after introduction of tens of thousands of DSBs by the domesticated transposase PiggyMac (Pgm)These rearrangements consist in: the precise excision of thousands of unique and non coding sequences called IESs that interrupt 47% of genes in the germline; and the heterogeneous elimination of repeated sequences. It leads to internal deletions of variable sizes or to chromosome fragmentation with telomere addition at DNA ends.Implication of the Non Homologous End Joining Pathway (NHEJ) in precise IES excision has been proved. In cells depleted for Ligase IV or XRCC4, DSBs at IES boundaries are introduced normally but broken DNA ends accumulate without being repaired nor degraded. The repair pathway implicated in heterogeneous rearrangements is still unknown. An hypothesis would be that heterogeneous rearrangements involve a Ku independent alternative NHEJ (alt-NHEJ) pathway characterized by end resection and use of microhomologies. During my thesis I studied the role of Ku proteins in programmed genome rearrangements.Two KU70 genes and three KU80 genes has been identified in the Paramecium genome. KU70a and KU80c are specifically induced during programmed genome rearrangements. Encoded proteins localize in developing somatic nuclei. Gene extinction by RNA interference experiments proved that these genes are necessary for programmed genome rearrangements. At molecular level, non rearranged DNA is amplified in cells depleted for Ku. And more surprisingly, no programmed DSBs are introduced at IES boundaries in these cells.My results indicate that Ku is a part of a pre excision complex with the domesticated transposase Pgm and necessary for the introduction of programmed DSB during programmed genome rearrangements.