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Molecular mechanism and enzymological studies of dye-decolorizing peroxidases (DyPs) from Thermomonospora curvata and Enterobacter lignolyticusShrestha, Ruben January 1900 (has links)
Doctor of Philosophy / Department of Chemistry / Ping Li / Dye-decolorizing peroxidases (DyPs) comprise a new family of heme peroxidases, which have received much attention due to their potential applications in degradation of lignin and anthraquinone dyes. In this research, studies of two types of DyPs are carried out and reported in the following three sections. The first section includes the identification and characterization of class-A TcDyP from Thermomonospora curvata, a thermophilic actinomycete found in composted manure. The TcDyP was found to be highly active toward a wide range of substrates including phenolic lignin model compounds. Transient- and steady state- kinetics involving wild-type (wt) and mutant TcDyPs revealed that Asp220 and Arg327 are essential for compound I formation and reduction of compound II to resting state is the rate-limiting step. Additionally, replacement of His312 and Arg327 shifted the redox potential (E°′) to a more negative value. In the second section, the residues involved in the radical generation and substrate oxidation were explored. TcDyP contains 7 tryptophans and 3 tyrosines, which are the likely candidates of protein radicals and substrate oxidation sites. Crystal structure of TcDyP solved at 1.75Å revealed Trp263, Trp376 and Tyr332 as surface-exposed protein radical sites. Further studies using site-directed mutagenesis, steady-state and stopped-flow kinetics determined that the Trp263 is also one of the surface-exposed substrate oxidation sites. The Trp376 was characterized as the residue essential for covalent crosslinking of the enzyme units and an off-pathway electron sink. The highly conserved Tyr332 was found to be unimportant for substrate oxidation due to its extremely narrow surface exposure. The final section involves mechanistic study of a class-B DyP from Enterobacter lignolyticus (ElDyP), a bacterium capable of growing on lignin anaerobically. The crystal structure of ElDyP revealed the presence of two heme access channels measuring at ~3.0 and 8.0 Å in diameter and a water molecule as the sixth ligand to the heme center. Bisubstrate Ping-Pong mechanism was found operational in the catalytic cycle of ElDyP, in which conformational change of the enzyme resting state was proposed as the final step and the rate limiting step in the presence of ABTS. Microscopic events leading to Compound I formation was analyzed using D₂O₂. A kinetic isotope effect (KIE) of 2.4 at pD 3.5 suggested that Compound 0 is formed initially with protonation/deprotonation as the rate-limiting step. Compound I was directly reduced to the enzyme resting state via a 2-electron process, for which the rate increases as the pH decreases. Based on viscosity effect and solvent KIE (sKIE) with the reducing substrate, aquo release was found to be mechanistically important. Distal aspartate was proposed as the key residue that modulates the acidic pH optimum in Compound I reduction. These findings will pave the way for engineering DyPs for their applications in the degradation of lignin and synthetic dyes.
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New Secretory Peroxidases and Peroxygenases from Saprotrophic Fungi of Kenyan ForestsKimani, Virginia Wambui 29 January 2020 (has links)
Die vorliegende Dissertation befasst sich vor dem Hintergrund von pilzlicher Ökophysiologie und Umweltbiotechnologie mit der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von neuartigen Oxidoreduktasen aus kenianischen Pilzen (Eumycota). Unter Verwendung von selektiven, antibiotikahaltigen Agarmedien wurde 2016 eine Stammsammlung von 43 pilzlichen Isolaten angelegt, die Totholz, Laubstreu und Boden besiedelnde Arten umfasst und drei verschiedene kenianische Waldtypen und Biodiversitätsschwerpunkte berücksichtigt (ostafrikanische Regen-, Berg- und Küstenwälder). Die Isolate gehörten zu 21 Familien aus drei (Unter)stämmen: Basidiomycota, Ascomycota und Mucoromycotina. Unter ihnen befanden sich Weißfäulepilze und Streuzersetzer (aus den Familien Polyporaceae und Strophariceae), ein polyporaler Braunfäulepilz (Fomitopsis meliae) und zwei Vertreter der Familie Xylariaceae, die eine Moderfäule hervorrufen. Auf Grundlage morphologischer und molekularbiologischer Analysen konnte eine neue Art der Blätterpilz-Gattung Psathyrella identifiziert und als P. aberdarensis beschrieben werden. Extrazelluläre Aktivitäten von Unspezifischer Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-Typ-Peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) wurden für einige der pilzlichen Isolate nachgewiesen, u.a. für P. aberdarensis (PabUPO) und den ascomycetalen Moderfäulepilz Xylaria grammica (XgrDyP). Die zugehörigen Enzymproteine wurden gereinigt und biochemisch characterisiert. Die PabUPOs werden in Form von drei verschiedenen Isoenzymen/Isoformen exprimiert und realisieren ungewöhnlich breite pH-Profile bei entsprechend hoher Enzymstabilität. Sie gehören zur Proteinfamilie der “langen” UPOs und katalysieren typische Peroxygenierungen, u.a. die Oxidation von Alkoholen, die Spaltung von Ethern, die Demethylenierung, die Oxygenierung aromatischer Ringe und – darüber hinaus – die Oxidation von Formylfurancarbonsäure zu Furandicarbonsäure (eine spezifische Reaktion, die für die Herstellung von biobasierten Polyestern aus nachwachsenden Rohstoffen von Bedeutung ist). Bei der XgrDyP handelt es sich um die erste Wildtyp-DyP eines Ascomyceten; sie ist in der Lage, Peroxidase-Substrate wie ABTS und 2,6-Dimethoxyphenol, aber auch den Anthrachinon-Farbstoff Reactive Blue 5, Veratrylalkohol, und – bemerkenswerterweise – Mangan (Mn2+) zu oxidieren, was auf neue physiologische Funktionen dieses Enzymtyps hinweist. Die Genome der beiden Enzymbildner wurden sequenziert und annotiert, was die Identifizierung der zugehörigen Enzyme-kodierenden Gene erlaubte. Neben den beiden exprimierten PabUPO-Genen wurden 46 weitere putative UPO-Sequencen im Psathyrella-Genom gefunden. Aufgrund des Fehlens ligninolytischer Klasse-II-Peroxidasen in den Genomen beider Pilze wird angenommen, dass die charakterisierten Hämperoxidasen von ökophysiologischer Bedeutung für alternative Wege des Abbaus von Lignozellulosen oder Humus sind. Auf Basis des gefundenen Kernbestands an lignocellulolytischen CAZy-Enzymen (d.h. Cellulasen, lytische Polysaccharid-Monooxygenasen, Laccase, H2O2-bildende Oxidasen), können P. aberdarensis and X. grammica den ökophysiologischen Gruppen der streuzersetzenden Weißfäulepilze bzw. holzbesiedelnden Moderfäulepilze zugerechnet werden.:TABLE OF CONTENTS
LIST OF ABBREVIATIONS V
ZUSAMMENFASSUNG VII
SUMMARY IX
MUHTASARI XI
1 INTRODUCTION 1
2 MATERIAL AND METHODS 35
3 RESULTS 54
4 DISCUSSION 105
5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133
6 REFERENCES 137
7 APPENDIX 156 / The present dissertation deals, against the background of fungal eco-physiology and environmental biotechnology, with the isolation, purification and characterization of new fungal oxidoreducatses from Kenyan fungi (Eumycota). By using selective agar media supplemented with antibiotics, a culture collection comprising 43 fungal isolates dwelling in deadwood, leaf-litter and soil was established in 2016, considering three different Kenyan forest types and biodiversity hotspots (East African rainforest, mountain and coastal forests). The isolates turned out to belong to 21 families of the (sub)phyla Basidiomycota, Ascomycota and Mucoromycotina. Among them were white-rot and litter-decomposing fungi (from the families Polyporaceae and Strophariceae), a polyporous brown-rot species (Fomitopsis meliae) and two members of the family Xylariaceae causing soft-rot. By morphological and molecular analyses, a new species of the agaric genus Psathyrella was identified and described as Psathyrella aberdarensis. Extracellular activities of unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) and DyP-type peroxidase (DyP, EC 1.11.1.19) were demonstrated for a few of the fungal isolates, among them P. aberdarensis (PabUPO) and the soft-rot ascomycete Xylaria grammica (XgrDyP), respectively. The corresponding enzyme proteins were purified and characterized. PabUPOs occur in form of three different isoenzymes/isoforms realizing unusually broad pH-profiles and stabilities. They belong to the clade of ‘long’ UPOs and catalyze typical peroxygenations, i.e. alcohol oxidation, ether cleavage, demethylenation, aromatic ring oxygenation, and beyond that, the oxidation of formylfuran carboxylic acid into furandicarboxylic acid (a specific reaction in the preparation of bio-based polyesters from renewable building blocks). XgrDyP is the first wild-type DyP reported for an ascomycetous fungus and was found to oxidize peroxidase substrates such as ABTS and 2,6-DMP but also Reactive Blue 5, veratryl alcohol and notably manganese (Mn2+), suggesting novel physiological functions of this enzyme type. The genomes of both producer species were sequenced and annotated, which allowed the identification of the corresponding enzyme-encoding genes. Besides the two expressed PabUPO genes, a further 46 putative UPO sequences were identified in the Psathyrella genome. Due to the absence of ligninolytic class II peroxidases in the genomes of both fungi, the characterized heme peroxidases may be of eco-physiological relevance for alternative pathways degrading lignocellulosic materials or humus. Based on the core set of lignocellulolytic CAZy enzymes (i.e. cellulases, lytic monosaccharide monooxygenases, laccase, H2O2-generating oxidases), P. aberdarensis and X. grammica can be classified within the eco-physiological groups of litter-decomposing white-rot and wood-colonizing soft-rot fungi, respectively.:TABLE OF CONTENTS
LIST OF ABBREVIATIONS V
ZUSAMMENFASSUNG VII
SUMMARY IX
MUHTASARI XI
1 INTRODUCTION 1
2 MATERIAL AND METHODS 35
3 RESULTS 54
4 DISCUSSION 105
5 CONCLUSION AND OUTLOOK 133
6 REFERENCES 137
7 APPENDIX 156
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Molekularbiologische Charakterisierung von Häm-Thiolat- und DyP-type-Peroxidasen ausgewählter Basidiomyceten / Molecular biological charaterization of heme-thiolate and DyP-type peroxidases of selected basidiomycetesPecyna, Marek 08 December 2016 (has links) (PDF)
Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe. / For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats.
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Molekularbiologische Charakterisierung von Häm-Thiolat- und DyP-type-Peroxidasen ausgewählter BasidiomycetenPecyna, Marek 30 May 2016 (has links)
Peroxidasen des Typs ClassII sowie die Chlorperoxidase waren für mehrere Jahrzehnte die einzigen bekannten sekretorischen Hämperoxidasen aus Pilzen. Im Jahr 2004 wurde eine neue, ungewöhnliche Hämperoxidase aus dem Speisepilz Agrocybe aegerita isoliert und biochemisch charakterisiert. Diese Peroxidase, heute offiziell Unspezifische Peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1) genannt, vereint in sich Eigenschaften sowohl intrazellulärer Cytochrom-P450-Enzyme als auch klassischer extrazellulärer, pilzlicher Peroxidasen des Typs ClassII. In dieser Arbeit wurden für den UPO-Modellorganismus A. aegerita und für andere UPO-produzierende Pilze erstmals Nukleotidsequenzen der Enzyme ermittelt und phylogenetisch analysiert. Die Genome zweier Stämme von A. aegerita wurden sequenziert. Die Ergebnisse legen nahe, dass UPOs gemeinsam mit der Chlorperoxidase Vertreter einer phylogenetisch alten Protein-Superfamilie (Häm-Thiolat-Peroxidasen) darstellen, die in allen echten Pilzen (Eumycota) zu finden ist, aber in echten Hefen und einigen hefeartig wachsenden Basidiomyceten sekundär reduziert wurde. Die natürliche Funktion dieser extrazellulären Enzyme ist bislang unbekannt. Im Labor können UPOs ausschließlich unter Verwendung leguminosenhaltiger Kulturmedien induziert werden. Die induzierende Komponente aus Soja wurde in dieser Arbeit als proteinogen identifiziert. Eine zweite neue, extrazelluläre Hämperoxidase-Superfamilie ausserhalb der ClassII-Peroxidasen wurde im Totholz bewohnenden Pilz Bjerkandera adusta entdeckt. Die als DyP-type-Peroxidasen benannten Enzyme (DyP, EC 1.11.1.19) wurden später auch in anderen Pilzen gefunden, von denen in dieser Arbeit ebenso Nukleotidsequenzen erhalten wurden. Die phylogenetische Analyse ergab, dass pilzliche Sequenzen der DyP-type-Peroxidase-Superfamilie sehr ungleichmäßig sowie ausschließlich in den Genomen höherer Pilze (Dikarya) verteilt sind und vermutlich einen prokaryotischen Ursprung haben. Transkripte von UPO- und DyP-Genen wurden in nahezu allen untersuchten Laubstreuproben aus unterschiedlich stark genutzten Waldgebieten der Deutschen Biodiversitätsexploratorien nachgewiesen. Dies legt eine biologische Funktion dieser neuen Hämperoxidase-Superfamilien in entsprechenden Habitaten nahe.:Abkürzungsverzeichnis 1
1. Einleitung 5
2. Theoretische Grundlagen 7
2.1. Hämperoxidasen 7
2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7
2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10
2.1.3. Systematik 16
2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36
2.3. DyP-type-Peroxidasen 38
3. Anliegen der Arbeit 41
4. Material und Methoden 43
4.1. Organismen 43
4.2. Chemikalien 53
4.3. Methoden 55
4.3.1. Kultivierung 55
4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56
4.3.3. PCR 57
4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62
4.3.5. Protein-Sequenzierung 62
4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63
4.3.7. Genomsequenzierungen 73
4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76
4.3.9. Phylogenetische Analysen 77
4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79
4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80
4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83
4.3.13. SDS-PAGE 83
4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83
4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85
4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium
89
5. Ergebnisse 91
5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91
5.1.1. Sequenzen 91
5.1.2. Phylogenetische Analyse 110
5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113
5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116
5.2. DyP-type-Peroxidasen 126
5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126
5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130
5.2.3. Phylogenetische Analyse 135
5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137
5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142
6. Diskussion 143
6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143
6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144
6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex
147
6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150
6.2.3. Biologische Funktion 152
6.2.4. Phylogenetik 154
6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159
6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165
6.3. DyP-type-Peroxidasen 166
6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166
6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168
6.3.3. Biologische Funktion 168
6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169
6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170
6.3.6. Heterologe Expression 171
7. Ausblick 173
8. Thesen 177
Literaturverzeichnis 179
A. Peptidsequenzen 225
B. Genspezifische Oligonukleotide 231
C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241
D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255
E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261
F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267
G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271
H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275
I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283
J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285
K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289
L. Publikationen 293
Danksagung 371
Rechtliche Erklärungen 373 / For several decades ClassII peroxidases and chloroperoxidase have been the only known secretory heme peroxidases from fungi. In 2004, a novel heme peroxidase was isolated and characterized from the edible mushroom Agrocybe aegerita. This enzym, nowadays called unspecific peroxygenase (UPO, EC 1.11.2.1), combines characteristics of intracellular cytochrom P450 enzymes as well as extracellular classII fungal peroxidases. In the course of this PhD work, for the first time nuleotide sequences of UPO model organism A. aegerita as well as other UPO producing fungi were obtained and phylogenetically analyzed. The whole-genome sequences of two strains of A.aegerita were obtained. The results suggest that UPOs and the chloroperoxidase together represent a phylogenetically old protein superfamily (of heme-thiolate peroxidases) that is found in all true fungi (Eumycota), but is secondarily reduced in true yeasts and a few yeast-like growing basidiomycetes. The natural function of these enzymes remains unclear. In the laboratory, fungi secrete UPOs solely in legume-containing culture media. The eliciting component of the legume soybean has been determined as proteinogenic. A second novel heme peroxidase superfamily outside the classII peroxidases was discovered in deadwood inhabiting fungus Bjerkandera adusta. These so-called DyP-type peroxidases (DyP, EC 1.11.1.19) were later found expressed in several other fungi for which nucleotide sequences were obtained in this work, too. Phylogenetical analysis revealed that fungal DyP sequences are exclusively but very unequally distributed in genomes of higher fungi (Dikarya). Fungal DyP sequences are seemingly decended from prokaryotes. Transcripts encoding UPOs and DyPs were found in almost every sample of leave litter (derived from forests with different intensity of human usage) investigated. This suggests biological functions of these new heme peroxidase superfamilies in respective habitats.:Abkürzungsverzeichnis 1
1. Einleitung 5
2. Theoretische Grundlagen 7
2.1. Hämperoxidasen 7
2.1.1. Häm – Pigment des Lebens 7
2.1.2. Mechanismus der Hämperoxidase-vermittelten Katalyse 10
2.1.3. Systematik 16
2.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 36
2.3. DyP-type-Peroxidasen 38
3. Anliegen der Arbeit 41
4. Material und Methoden 43
4.1. Organismen 43
4.2. Chemikalien 53
4.3. Methoden 55
4.3.1. Kultivierung 55
4.3.2. Nukleinsäure-Isolation und cDNA-Synthese 56
4.3.3. PCR 57
4.3.4. Klonierung und DNA-Sequenzierung 62
4.3.5. Protein-Sequenzierung 62
4.3.6. Sequenzierungsstrategien 63
4.3.7. Genomsequenzierungen 73
4.3.8. Transkriptomsequenzierung 76
4.3.9. Phylogenetische Analysen 77
4.3.10. Vorhersage von Gen- und Protein-Eigenschaften 79
4.3.11. Photometrische Enzymaktivitätsmessung 80
4.3.12. Proteinkonzentrationsbestimmung 83
4.3.13. SDS-PAGE 83
4.3.14. Hämperoxidasen in der Streuschicht von Laubwäldern 83
4.3.15. UPO-Induktionsversuche 85
4.3.16. Partielle Charakterisierung sekretierter Peptidasen im Sojamedium
89
5. Ergebnisse 91
5.1. Häm-Thiolat-Peroxidasen 91
5.1.1. Sequenzen 91
5.1.2. Phylogenetische Analyse 110
5.1.3. UPO-Geninventar und UPO-Aktivität im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex 113
5.1.4. Physiologie der UPO-Bildung in A. aegerita TM-A1 116
5.2. DyP-type-Peroxidasen 126
5.2.1. Sequenzen charakterisierter Enzyme 126
5.2.2. Sequenzen hypothetischer Enzyme 130
5.2.3. Phylogenetische Analyse 135
5.3. Genom- und Transkriptomsequenzierung von A. aegerita TM-A1 und AaN 137
5.4. Hämperoxidasen in Umweltproben 142
6. Diskussion 143
6.1. Sekretorische Peroxidasen aus Pilzen 143
6.2. Häm-Thiolat-Peroxidasen 144
6.2.1. UPO-Geninventar und -expression im Agrocybe-aegerita-Multispezieskomplex
147
6.2.2. Induktion der Unspezifischen Peroxygenase in A. aegerita TM-A1 150
6.2.3. Biologische Funktion 152
6.2.4. Phylogenetik 154
6.2.5. Cytochrom-P450-Enzyme 159
6.2.6. Ein Vorschlag zur Nomenklatur 165
6.3. DyP-type-Peroxidasen 166
6.3.1. Differentiell exprimierte Isoenzyme 166
6.3.2. Hypothetische Sequenzen 168
6.3.3. Biologische Funktion 168
6.3.4. Prokaryotischer Ursprung pilzlicher DyP-type-Peroxidasen 169
6.3.5. DyPs sind Teil der strukturellen CDE-Superfamilie 170
6.3.6. Heterologe Expression 171
7. Ausblick 173
8. Thesen 177
Literaturverzeichnis 179
A. Peptidsequenzen 225
B. Genspezifische Oligonukleotide 231
C. Verbreitung von HTP-Sequenzen 241
D. Verbreitung von DyP-Sequenzen 255
E. Charakterisierte ClassII-Peroxidasen 261
F. ClassII-Aktivitäten in Reinkulturen 267
G. Physiologie von A. aegerita TM-A1 in Sojamedien 271
H. Einfluss der Soja-Inhaltsstoffe auf die UPO-Produktion in A. aegerita TM-A1 275
I. Inhaltsstoffe von Sojamedien 283
J. Transkriptomanalyse A. aegerita TM-A1 285
K. Bakterielle DyP-type-Peroxidasen 289
L. Publikationen 293
Danksagung 371
Rechtliche Erklärungen 373
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