Complex cellular processes involve the specific and coordinated expression of networks of genes in space and time. This thesis explores existing and novel high-throughput methods of measuring gene transcription in such dynamic systems. We used expression microarrays to perform a time series analysis of differentiating C2C12 myoblasts, with dense temporal sampling within the first day of differentiation. Analysis of this data revealed that a large proportion of transcriptional regulators (TRs) are differentially expressed early in myogenesis. Using a high-content shRNA screen, we identified 48 TRs that significantly inhibit myogenesis when knocked down. These include known regulators of myogenesis, but also 26 TRs not previously associated with the process. In addition to showing the requirement of many differentially expressed genes during differentiation, our data also reveals that stably expressed genes are critical components to complex processes such as myogenesis. / Current approaches to measuring transcriptional changes in high throughput rely on discrete measurements of signals that have been averaged over large numbers of cells. To address these limitations, we developed a high-throughput platform called the Living Microarray for measuring transcriptional changes in single mammalian cells at a high temporal sampling density. By combining reverse-transfection microarrays with automated fluorescence microscopy, we are able to make single-cell expression measurements of inducible fluorescent reporters transfected in 600 independent clusters of cells over 24 hours. Automated segmentation and tracking of over 11 million cells revealed that cells display substantial heterogeneity in their responses. Our method is scalable and readily adaptable to studying other systems, including cell proliferation, differentiation and apoptosis. / Les processus cellulaires nécessitent l'expression spécifique et coordonnée de réseaux de gènes de façon temporelle et spatiale. Cette thèse explore des méthodes à haut-débit, ainsi que de nouvelles techniques qui mesurent la transcription de gènes dans de tels systèmes dynamiques. Nous avons utilisé les puces à ADN pour effectuer une analyse chronologique de la transcription des gènes impliqués dans la différenciation des cellules myoblastiques C2C12. En particulier, nous avons utilisé un échantillonnage à intervalle court durant le premier jour de la différenciation. L'analyse de ces données a révélé qu'une forte proportion des régulateurs transcriptionnels (RT) sont exprimés de façon différentielle au début de la myogenèse. En employant un criblage shRNA à haut-débit, nous avons identifié 48 RT nécessaires à la myogenèse. Parmi ceux-ci se trouvent plusieurs régulateurs connus, mais aussi 26 RT qui n'ont jamais été liés à ce processus. En plus de démontrer l'importance de nombreux gènes exprimés de façon différentielle tôt lors de la différenciation, nos données révèlent que les gènes exprimés de manière constante sont aussi des composantes essentielles pour les processus complexes tels que la myogenèse. / Les méthodes à haut-débit actuelles visant à mesurer la transcription génèrent des mesures uniques de signaux représentant la moyenne d'un grand nombre de cellules. Afin d'améliorer ces technologies, nous avons développé la Micropuce Vivante, une méthode à haut-débit qui mesure les changements de transcription dans des cellules vivantes de mammifères à plusieurs intervalles très courts. En combinant des puces à transfection inverse avec la microscopie à fluorescence automatisée, nous pouvons mesurer l'induction de gènes fluorescents transfectés dans 600 groupes de cellules pendant 24 heures ou plus. L'analyse détaillée de plus de 11 millions de cellules a révélé qu'il existe une hétérogénéité importante entre cellules en ce qui concerne leur réponse au traitement. Notre méthode peut être utilisée pour l'étude de plusieurs systèmes, comme la division cellulaire, la différenciation cellulaire et l'apoptose.

During liver transplantation, donor organs experience some degree of cold ischemia/reperfusion injury (IRI). The magnitude of this preservation injury is critical for transplantation outcome since it influences the allograft early function. However, the multifactorial and complex cellular response initiated upon IRI remains unclear. Herein, we used liver biopsies collected during the early phases of organ procurement and transplantation to characterize the global patterns of protein expression and phosphorylation in order to identify new regulatory mechanisms involved in ischemia-induced graft damage. / First, a targeted functional proteomic approach, which combined protein expression profiling and mass spectrometry phosphoproteins analysis, allowed us to identify IQGAP1, a Cdc42/Rac1 effector, as a potential regulator of IRI-induced actin cytoskeleton remodeling and the related bile canaliculi (BC) loss of integrity. We demonstrated that IQGAP1 expression and localization are affected upon IRI and related to actin reorganization. Furthermore, using an IRI model in hepatoma cells, we showed that IQGAP1 silencing decreases the basal level of actin polymerisation at BC periphery, reflecting a defect in BC structure, coincident with a reduced cellular resistance to IRI. / Our proteomic data also led us to postulate that IRI-induced cellular damages may cause alterations of the secretory pathway, suggesting the activation of endoplasmic reticulum (ER) specific stress responses. Using semi quantitative RT-PCR and immunoblot with phospho-specific antibodies, we showed that the IRE-1 pathway, leading to both adaptive and pro-apoptotic responses, is first activated upon early ischemia and, in a second phase, upon early reperfusion. In contrast, the PERK pathway, leading to inhibition of capdependent translation, is mainly activated upon reperfusion, restrictively in sinusoidal endothelial cells, and could contribute to the exagerated sensitivity of this liver cell type to IRI. / In summary, our work allowed to gain new mechanistic insights in the global regulation of the cellular response to IRI, and also led to the identification of new molecular mechanisms specifically involved in mediating liver resistance to IRI. First, IQGAP1, as a regulator of BC structure could be participate in maintaining a proper bile secretion, essential for graft post-transplant recovery. Then, the balance between pro-adaptive and pro-apoptotic responses triggered in the ER might, as well, influence liver secretory functions and, as a consequence, condition liver transplantation outcomes.

Over the course of the last decade, mesenchymal stromal cells (MSC) have made a remarkable entry in the field of cell-based immunotherapy. In vitro, MSC were shown to modulate the immune response, either by acting as an immunosuppressant on several immune cells, or upon IFN-γ stimulation, as an antigen presenting cell (APC) for the priming of CD4+ T cells. Although a vast array of in vivo experiments in animals and humans has undeniably proven the immunological properties of MSC, the exact mechanisms by which MSC mediate their effects remain unclear. In Chapter 1, I presented a succinct review of the literature in regards to the characteristics of MSC. In Chapter 2, I addressed the immunosuppressive mechanisms of human MSC toward T cell proliferation. Using an in vitro proliferation assay, I demonstrated that human MSC suppressed T cell proliferation through the expression indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) induced following IFN-γ priming. In addition, MSC derived from different donors were shown to suppress T cell proliferation at variable degrees, which corresponded to their individual expression level of IDO. The use of whole peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as opposed to purified T cells revealed the role played by monocytes in the suppression of T cell proliferation by MSC. Factors secreted by MSC in addition to the enzymatic activity of IDO induced the differentiation of monocytes into immunosuppressive M2 macrophages. Stimulation by IFN-γ not only triggered the immunosuppressive mechanisms of MSC but also induced APC-like properties in MSC. In Chapter 3, I investigated the molecular mechanisms implicated in the modulation of IFN-γ-inducible expression of MHC class II molecules and mediated antigen presentation in MSC. I demonstrated that IFN-γ mediated the transcriptional activation of the class II transactivator gene (CIITA), which is responsible for the upregulation of MHC class II molecules on both mouse and human MSC, and that TGF-β counter-acted the effect of IFN-γ by inhibiting the transcription of CIITA. In addition, cell culture density also modulated MHC class II-mediated antigen presentation differentially in mouse and human MSC. In Chapter 4, I examined the capacity of mouse MSC to cross-present exogenously acquired antigens as part of their APC-like features. I demonstrated that cross-presentation by mouse MSC was induced by IFN-γ and dependent on MHC class I machinery molecules, TAP complex and proteasome. I also demonstrated using an in vivo immune reconstitution assay, that mouse MSC can prime CD8+ T cells against a specific antigen, a characteristic of professional APC. Finally, I investigated in Chapter 5 the immunological impact of TLR expression and signaling in human and mouse MSC. I demonstrated that TLR activation in MSC induced the expression of chemokines and cytokines, which created an attractive inflammatory milieu for immune cells. I concluded by demonstrating that MSC differ from classic APC in that they did not express IL-12p70, an essential cytokine involved in both innate and adaptive immunity, in response to TLR activation. The findings in this thesis illustrate the complexity of the mechanisms by which MSC modulate the immune system. Their response to environment clues such as inflammation and pathogens activate either their suppressive or stimulatory immune functions, depending on the situation. Overall, these findings help optimize the utilization of MSC in cell-based immunotherapy. / Au cours de la dernière décennie, les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) ont fait une entrée remarquée dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire. In vitro, les MSC ont démontrées des propriétés immunomodulatrices, soit par leur action inhibitrice sur les fonctions des cellules du système immunitaire ou par leur capacité à présenter des antigènes aux lymphocytes T CD4+, à la suite d'une stimulation par IFN-. Malgré l'existence de nombreuses recherches in vivo chez les animaux et l'homme prouvant leurs propriétés immunologiques, les mécanismes par lesquels les MSC modulent le système immunitaire n'ont pas encore été élucidés. Dans le Chapitre 1, j'ai présenté une revue succincte de la littérature traitant des caractéristiques des MSC. Dans le Chapitre 2, j'ai adressé les mécanismes immunosuppressifs des MSC humaines sur les lymphocytes T. À l'aide d'un test de prolifération in vitro, j'ai démontré que les MSC humaines suppriment la prolifération des lymphocytes T par grâce à l'expression indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) induite par l'exposition à l'IFN-. De plus, les MSC isolées de différents donneurs inhibent la prolifération des lymphocytes T à différents degrés qui correspondent au le niveau d'expression d'IDO par chaque donneur. L'utilisation de cellules mononucléaires sanguines (PBMC) complet comparativement à l'utilisation de lymphocytes T purifiés a révélé le rôle joué par les monocytes dans la suppression de la prolifération des lymphocytes T par les MSC. L'activité enzymatique d'IDO en combinaison avec d'autres facteurs sécrétés par les MSC induisent la différentiation des monocytes en macrophages immunosuppressifs de type M2. En plus de déclencher les mécanismes immunosuppressifs des MSC, l'IFN-a aussi eu pour effet d'induire des propriétés typiques des cellules présentatrices d'antigène (CPA) chez les MSC. Dans le Chapitre 3, j'ai étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la modulation de l'expression des molécules MHC de type II et la présentation d'antigène par celles-ci dans les MSC. J'ai démontré que l'IFN- active la transcription du transactivateur de classe II (CIITA), ce qui a eu pour résultat d'uprégulation les molécules MHC de type II dans les MSC murines et humaines, et que l'ajout de TGF- contrecarre l'effet de l'IFN- en inhibant la transcription de CIITA. De plus, la densité cellulaire des MSC en culture module la présentation d'antigène en affectant l'expression des molécules MHC de type II différemment chez les MSC murines et humaines. Dans le Chapitre 4, j'ai examiné la capacité des MSC de souris à cross-présenter des antigènes exogènes, une autre propriété typique des CPA. J'ai démontré que l'IFN- induit la cross-présentation dans les MSC murines et que celle-ci dépend des molécules TAP et du protéasome. J'ai aussi prouvé à l'aide d'un modèle de reconstitution immunitaire in vivo, que les MSC murines peuvent induire l'activation des lymphocytes T CD8+ contre un antigène spécifique. Finalement, j'ai enquêté dans le Chapitre 5, l'impact immunologique de l'expression et de la signalisation par les TLR chez les MSC humaines et murines. J'ai illustré que l'activation des TLR induisait l'expression de chemokines et de cytokines par les MSC créant ainsi un milieu inflammatoire propice au recrutement des cellules immunitaires. J'ai conclue en démontrant que les MSC différaient des CPA classiques par l'absence de production IL-12p70, une cytokine essentielle à la réponse immunitaire innée et acquise, en réponse à la stimulation des TLR. Les résultats inclus dans cette thèse illustrent la complexité des mécanismes immunomodulatoires des MSC. Leurs réponses face aux signaux de leur environnement, tel que l'inflammation ou l'infection activent soit leurs propriétés immunosuppressives ou –stimulatrices dépendamment de la situation. Mes découvertes pourront optimiser l'utilisation des MSC dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire.

Normal development of the chorionic villi in human placenta is critical for proper exchange of nutrients and oxygen between the mother and the fetus. The chorionic villi of the placenta are formed by the differentiation of trophoblast cells into cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells, which are both important for proper placental function. Tmed2 was shown to be required for normal embryo and placental development in the mouse. In Tmed2 mutant embryos, the labyrinth layer of the placenta fails to form. The labyrinth layer of the mouse placenta is equivalent to the chorionic villi of the human placenta, and is essential for a successful pregnancy. We hypothesized that TMED2 is expressed in the human placenta, and could be involved in trophoblast differentiation. The objectives of this study are to characterize TMED2 expression in first trimester and term human placenta, and to compare TMED2 mRNA and protein levels in two cell lines, BeWo and JEG-3, that are widely used for studying trophoblast differentiation. We found by immunocytochemistry that TMED2 is expressed in both first trimester and term human placenta. We also found that TMED2 is expressed in BeWo cells, which are known to form syncytiotrophoblast after forskolin treatment, but not expressed in JEG-3 cells, which do not undergo syncytiotrophoblast differentiation. / Le développement normal des villosités choriales dans le placenta humain est essentiel pour l'échange adéquat des nutriments et de l'oxygène entre la mère et le fœtus. Les villosités choriales du placenta sont formées par la différentiation des cellules du trophoblaste en cellules de cytotrophoblaste et syncytiotrophoblaste, qui sont essentielles pour le fonctionnement du placenta. Tmed2 a été démontré comme étant requis pour le développement normal de l'embryon et du placenta chez la souris. Dans les embryons mutants pour Tmed2, la couche labyrinthe du placenta ne se forme pas. La couche labyrinthe du placenta de souris est l'équivalent des villosités choriales du placenta humain, et est requise pour une grossesse saine. Nous avons donc émis l'hypothèse que TMED2 est exprimé dans le placenta humain, et pourrait être impliquée dans la différentiation du trophoblaste. Les objectifs de cette étude sont de caractériser l'expression de TMED2 dans le placenta humain du premier trimestre et à terme, ainsi que de comparer les niveaux des protéines et d'ARNm de TMED2 dans deux lignées cellulaires, BeWo et JEG-3, qui sont couramment utilisées pour étudier la différentiation des trophoblastes. Nous avons trouvé par immunocytochimie que TMED2 est exprimé dans le placenta de premier trimestre et à terme chez l'humain. Nous avons aussi démontré que TMED2 est exprimé dans les cellules BeWo qui forment des synctyiotrophoblastes après traitement à la forskoline, mais n'est pas exprimé dans les cellules JEG-3 qui ne subissent pas de différentiation en syncytiotrophoblastes

A major drawback of cartilage tissue engineering is that human mesenchymalstem cells (hMSCs) from osteoarthritic (OA) patients express high levels of typeX collagen. Type X collagen is a marker of late stage chondrocyte hypertrophy, linked with endochondral ossification. It has been shown that a novel plasmapolymer, called nitrogen-rich plasma-polymerized ethylene (PPE:N), is able to inhibit type X collagen expression in committed MSCs. The aim of this study was to determine if the decreased expression of type X collagen, induced by PPE:N, is maintained when MSCs are transferred to pellet cultures, an arrangement of cells which mimics embryonic condensation of mesenchymal stem cells, which results in prehypertrophic chondrocytes. hMSCs were obtained from the bone marrow of donors undergoing total hip replacement for OA. hMSCs were cultured on polystyrene dishes and on two different PPE:N surfaces: high (H) and low (L)pressure deposition for 7 days. Cells were transferred for 7 additional days in serum free media in pellet culture. RNA was extracted using a standard TRIzolprotocol. RNA was subjected to RT-PCR using primers specific for type I and X collagen. As observed in previous studies, type X collagen mRNA level was suppressed when cultured on both H- and L-PPE:N. HPPE:N was more effective in decreasing type X collagen expression than LPPE:N. Results also showed that the decreased type X collagen expression was maintained when cells were removed from the PPE:N surfaces and transferred to pellet cultures. Culturing hMSCs from OA patients on PPE:N surfaces and in pellet culture had however no effect on the level of type I collagen mRNA. The present study confirmed the potential of PPE:N surfaces in suppressing type X collagen expression in hMSCs from OA patients. More importantly, when these cells are transferred to pellet cultures, type X collagen suppression is maintained. These results show a promising future for tissue engineering using autologous hMSCs. / Un inconvénient majeur de l'ingénierie tissulaire du cartilage est dû aux niveaux de collagène de type X élevés exprimés dans les cellules souches mésenchymateuses (CSM) des patients arthritiques. Le collagène de type X est un marqueur de l'hypertrophie avancée des chondrocytes, qui est lié à l'ossification endochondrale. Il a été démontré que l'expression du collagène de type X par les CSM différenciées peut être inhibée en présence des polymères plasma enrichies d'azote (PPE:N, nitrogen-rich plasma-polymerized ethylene). Le but de cette étude était de déterminer si la diminution de l'expression du collagène de type X, induite par PPE:N serait maintenue lorsque les CSM sont transférée dans des cultures culots. Les dernières sont un arrangement de cellules mimant la condensation embryonique des CSM résultant ainsi en des chrondrocytes prehypertrophiques. Les CSM ont été obtenus à partir de la moelle osseuse des donneurs subissant une arthroplastie totale de la hanche. Les CSM ont été cultivées sur des boîtes de polystyrène, ainsi que sur deux surfaces de PPE:N différents; à haute (H) et à faible (L) pression de dépôt pendant 7 jours. Les cellules ont été transférées pour 7 jours supplémentaires dans des milieux sans sérum dans la culture culot. L'ARN a été extrait selon un protocole standard TRIzol. L'ARN a été soumis à la RT-PCR avec des amorces spécifiques pour les collagènes de type I et X. Tel qu'observé dans des études antérieures, la quantité de ARNm de collagène X été supprimée lorsque les CSM était cultivées sur les surfaces HPPE:N et LPPE:N. Le HPPE:N était plus efficace pour diminuer l'expression de collagène de type X que le LPPE:N. De plus, la diminution d'expression du collagène de type X a été maintenue bien que les cellules ont été retirées de la surface PPE:N et transférées à des cultures culots. Cependant, le niveau de ARNm du collagène de type I récupéré dans les patients atteints d'arthrose n'a pas été influencé par les surface PPE:N, ni par la culture culot. Cette étude a établie le potentiel des surfaces PPE:N en supprimant l'expression de collagène de type X par les CSM chez les personnes souffrant d'arthrose. Plus important encore, lorsque ces cellules sont transférées à des cultures culots, la suppression du collagène de type X est maintenue. Ces résultats montrent un avenir prometteur pour l'ingénierie tissulaire en combinaison avec les CSM autologues.

Chemotropic cues guide the migrating axons of neurons in the developing nervous system. Netrins are bifunctional guidance cues, attracting or repelling different classes of axons. The attraction to netrins is mediated by DCC whereas repulsion is achieved through Unc5H receptors. In this thesis, we demonstrate that Rho GTPases are required for embryonic spinal commissural axon outgrowth induced by Netrin-1. Using N1E-115 neuroblastoma cells, we have found that Rac1 and Cdc42 activities are required for DCC-induced neurite outgrowth. In fibroblasts, DCC was found to trigger actin reorganization through activation of Rac1. Moreover, we show that Unc5H1 triggers actin reorganization through activation of RhoA in fibroblasts. Using N1E-115 cells we found that Unc5H1 induces neurite outgrowth in a Rac1- and Cdc42-dependent manner. The studies presented in this thesis demonstrate that Rho GTPases are major signaling components of Netrin-1 receptors DCC and Unc5H1.

Fibrillins are large structural glycoproteins in the extracellular matrix that multimerize to form microfibril suprastructures in connective tissues. Fibrillin-containing microfibrils confer mechanical stability to tissues and regulate bioavailability of the transforming growth factor beta (TGF-β) superfamily. Mutations in fibrillin-1 lead to a number of fibrillinopathies, most notably, Marfan syndrome (MFS), an autosomal dominant connective tissue disorder affecting the cardiovascular, ocular and skeletal system. It has been shown in animal models recapitulating MFS that enhanced levels of active TGF-β1 trigger the typical MFS phenotype.We report that recombinant fibrillin-1 fragments expressed in HEK293 cells and purified by metal affinity chromatography contained active TGF-β1 and its latent form, LAP-TGF-β1. Further analysis of the purification scheme demonstrated that TGF-β1 secreted by HEK293 cells non specifically co purified with fibrillin-1 fragments, and was present in all protein preparations. We demonstrate that non specific co purification of active TGF-β1 and LAP-TGF-β1 was eliminated by gel filtration chromatography, under high salt conditions, for fibrillin 1 fragments spanning the N-terminal and C-terminal half of the protein. However, gel filtration chromatography of the central fibrillin-1 fragment, rF20, did not completely dissociate LAP-TGF-β1 associated with this fragment, suggesting an interaction between rF20 and LAP-TGF-β1. / Les fibrillines sont de larges glycoprotéines structurales dans la matrice extracellulaire qui multimérisent pour former des suprastructures microfibrillaires dans les tissus conjonctifs. Les microfibrilles contenant les fibrillines confèrent la stabilité tissulaire et régulent la biodisponibilité de la superfamille des facteurs de croissance transformant beta (TGF-β). Les mutations dans la fibrilline-1 entraînent des fibrillinopathies, dont la plus commune est le syndrome de Marfan (MFS). Le MFS est une maladie génétique à transmission autosomique dominante des tissus conjonctifs affectant les systèmes cardiovasculaire, oculaire et squelettique. À partir de modèles animaux, il a été démontré qu'une augmentation des niveaux de TGF-β actifs est observée dans les animaux ayant le phénotype de MFS par rapport aux animaux contrôle. Dans cette étude, nous démontrons que des fragments de la fibrilline-1 recombinante exprimés par des cellules HEK293 et purifiés par chromatographie d'affinité métallique contiennent du TGF-β1 sous forme active et sous forme latente (LAP- TGF-β1). Des analyses subséquentes du schéma de la purification démontrent que le TGF-β1 sécrétés par les cellules HEK293 sont co-purifiées de manière non spécifiques avec les fragments de la fibrilline-1, et que ce facteur de croissance était présent dans toutes les préparations protéiques. Nous avons aussi démontré que la co-purification non-spécifique de la TGF-β1 sous forme active ou la LAP-TGF-β1 était éliminée par chromatographie d'exclusion en présence de concentration saline élevée pour les fragments représentant les moitiés de la fibrilline-1 en C-terminal et N-terminal. Cependant, la chromatographie d'exclusion du fragment rF20, représentant la partie centrale de la fibrilline-1, n'a pas complètement dissocié la LAP-TGF-β1 associée avec ce fragment, suggérant une interaction entre ce fragment et la LAP-TGF-β1.

The low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) is a single transmembrane receptor that mediates the endocytosis of over 40 different ligands. Although LRP1 is traditionally classified as a scavenger receptor due to its role in lipoprotein uptake and its large selection of ligands, recent studies have shown strong evidence in its role in cellular signaling. The PTB domain-containing engulfment adapter protein 1 (GULP) is the adapter protein regulating the endocytosis of LRP1. Previous studies in our laboratory have presented the effect of GULP on lipid homeostatsis, where elevated GULP expression resulted in accumulation of glycoshpingolipids in the lysosome. Moreover, GULP overexpression also prevented the lipid degradation cofactor prosaposin from entering lysosome, where prosaposin is internalized by LRP1 and proteolytically cleaved into the active form. Based on our previous observation, we have hypothesized that GULP is a molecular switch governing the transition between early endosome (EE) and late endosome (LE) for LRP1 mediated endocytosis. To validate our hypothesis, confocal microscopy was preformed to monitor the endocytosis of fluorescently labeled LRP1 specific and non-specific ligands. In CHO cells with elevated GULP expression level (FL), LRP1 specific ligands strongly co-localized with EE, where as the co-localization between LRP1 ligands and LE was enhanced in CHO cells with lowered GULP expression level (AS). However, the intracellular trafficking of non-LRP1 ligands was not affected by GULP. Moreover, observation on slower degradation of iodine-125 ([125]I) labeled alpha-2-macroglobulin (α2M) and enhanced resistance to the lysosomal toxin, pseudomonas exotoxin A (PEA) in FL cells further reinforced our hypothesis since both ligands are LRP1 specific.Recent reportshave presented evidences on the involvement of LRP1 in TGF-β signaling, an important pathway regulating cell proliferation and tumorigenesis in many cancers. Therefore, we were interested in examining the potential effect of GULP on transforming growth factor-β (TGF-β) signaling. Firstly, FL cells had enhanced TGF-β response, which resulted in increasing cell growth arrest, cell migration and cell invasion, which is verified by a prolonged SMAD3 phosphorylation and increased luciferase-reporter activity. Furthermore, transfection of GULP into the TGF-β insensitive ovarian adenocarcinoma (HEY) cells restored the TGF-β responsiveness, as measured by SMAD3 phosphorylation and impairment of cell growth. In conclusion, our data has defined GULP as an important protein regulating LRP1 mediated endocytosis and LRP1 mediated TGF-β signaling. / Le low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) est un récepteur transmembranaire simple qui médie l'endocytose de plus de 40 ligands différents. Bien que LRP1 est traditionnellement considéré comme un récepteur scavenger en raison de son rôle dans l'absorption des lipoprotéines et de son grand choix de ligands, des études récentes ont montré des preuves solides de son rôle dans la signalisation cellulaire. Le PTB domain-containing engulfment adapter protein 1 (GULP) est une protéine adaptateur qui contrôle l'endocytose du LRP1. Les études précédentes effectuées dans notre laboratoire ont montré l'effet du GULP sur l'homéostasie du lipide, d'où une expression élevée du GULP a abouti une accumulation de glycosphigolipide dans le lysosome. Par ailleurs, une surexpression du GULP a également empêché le cofacteur de la dégradation du lipide prosaposine d'entrer dans les lysosomes, d'où le prosaposine est internalisé par le LRP1 et clivé par la protéolyse à sa forme active.Basés sur nos observations antérieures, nous avons émis une hypothèse que le GULP est un interrupteur moléculaire qui contrôle la transition entre l'endosome précoce (EE) et l'endosome tardif (LE) pour l'endocytose médiée par le LRP1. Pour valider notre hypothèse, le microscope confocal a été utilisé pour surveiller l'endocytose des ligands fluorescents qui étaient LRP1 spécifique et des ligands fluorescents qui étaient LRP1 non spécifique. Dans les cellules du CHO avec un niveau d'expression du GULP élevée (FL), les ligands qui sont LRP1 spécifique ont fortement colocalisé avec EE, alors que la colocalisation des ligands du LRP1 et du LE était stimulée dans les cellules du CHO avec un niveau d'expression de GULP faible (AS). Cependant, le trafic intercellulaire des ligands non LRP1 n'était pas affecté par le GULP. De plus, l'observation sur le ralentissement de la dégradation de l'alpha-2-macroglobuline (α2M) étiqueté par l'iode-125 ([125] I) et sur une meilleure résistance à la toxine lysosomale, exotoxine A de Pseudomonas (PEA) dans les cellules FL, a renforcé notre hypothèse puisque les deux ligands sont LRP1 spécifiques.Des rapports récents ont présenté des preuves concernant l'implication du LRP1 dans la signalisation du transforming growth factor-β (TGF-β), une voie importante dans la régulation de la prolifération cellulaire et de la tumorigenèse dans de nombreux cancers. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à examiner les effets potentiels de GULP sur la signalisation du TGF-β. Tout d'abord, les cellules FL ont amplifié la réponse des cellules au TGF-β, ce qui a entraîné une augmentation dans les arrêts à la croissance cellulaire, dans la migration cellulaire, et dans l'invasion cellulaire, ceci a été vérifié par une phosphorylation prolongée du SMAD3 et par une augmentation de l'activité du reporteur luciférase. En suite, la transfection du GULP dans les cellules d'adénocarcinome ovarien qui étaient TGF-β insensible (HEY) a réactivé la réactivité envers le TGF-β, telle que mesurée par la phosphorylation du SMAD3 et par des déficiences de la croissance cellulaire. En conclusion, nos données ont défini le GULP étant une protéine important dans la régulation de l'endocytose médiée par le LRP1 et dans la signalisation du TGF-β médiée par le LRP1.

In this study, the function and regulation of Rab-A1 proteins are investigated in the model plant species Arabidopsis. Rab proteins are a family of small Ras-like GTPases that regulate the vesicle transport during membrane trafficking. The subfamily of Rab-A proteins, homologues of Ypt31/32 in yeast and Rab11 in animals, is greatly elaborated in plants. In Arabidopsis, 26 out of 57 putative Rab proteins are Rab-A members and they can be further categorized into 6 subclasses from Rab-A1 to Rab-A6. The unique radiation of the Rab-A subfamily in the plant lineage is thought to be a mechanism to meet the dynamic membrane trafficking around the trans-Golgi network (TGN) in plant cells. With fluorescence based imaging, I revealed that, RAB-A1c, a member of the Rab-A1 subclass, is strongly co-localized with members of the Rab-A2 and Rab-A4 subclasses in a population of TGN that only partially overlaps with VHA-a1-mRFP, a TGN marker. RAB-A1c is relocated to the growing cell plate in mitotic cells. Interestingly, this RAB-A1c positive compartment and the relocation of RAB-A1c to the cell plate in mitotic cells are sensitive to endosidin1 (ES1), a drug recently identified as an actin stabilizer that selectively interrupts recycling of several plasma membrane proteins from the TGN. Furthermore, although there is likely functional redundancy in Rab-A1 members, the root growth of rab-a1a/b/c triple mutant is slightly retarded and, importantly, it displays hypersensitivity to ES1. Histological staining revealed that enhanced defect in cytokinesis contributes to ES1 hypersensitivity in root growth of the triple mutant. Thus, I conclude that Rab-A1 proteins are involved in cytokinesis and they act in a membrane trafficking pathway(s) that is sensitive to ES1.As the molecular switch of membrane trafficking, Rab proteins are under the regulation of the guanine exchange factor (GEF). In yeast, TRAPPII (transport protein particle II), a ten-subunit protein complex (seven subunits shared with TRAPPI including Trs20, Trs23, Trs31, Trs33, Trs85, Bet3 and Bet5, and three TRAPPII specific subunits including Trs65, Trs120 and Trs130) has been reported as a GEF for Ypt31/32. Using a combined approach of in-vivo imaging and genetics, we revealed that mutations in AtTrs120 and AtTrs130, homologues of two TRAPPII-specific subunits in Arabidopsis, cause defect in cytokinesis as well as in cell polarity. In the background of attrs120 and attrs130, vesicles and tubular-vesicular structures are abnormally accumulated, but ER-Golgi transport, trafficking route to the vacuole and endocytosis appear normal. Using secGFP as a secretion marker, I revealed that transport of secGFP can be inhibited at the TGN. In addition, recycling of PIN2 and AUX1, but not PIN1 is also impaired in attrs120 or attrs130. I found that a functional YFP fused AtTrs130 co-localizes with GFP-RAB-A1c at a population of TGN that is sensitive to ES1. In attrs130, however, the majority of GFP-RAB-A1c is delocalized to the cytosol. Furthermore, the constitutive active RAB-A1c(Q72L), but not RAB-D2a(Q67L), could partially rescue attrs130 in root growth. Taken together, I conclude that TRAPPII in Arabidopsis may function upstream of RAB-A1c, possibly as a GEF, in post-Golgi membrane trafficking. / Au cours de cette étude, je me suis intéressée à la fonction et à la régulation des protéines Rab-A1 au cours de la division cellulaire chez Arabidopsis.Parmis la famille de petites GTPases Ras-like, la sous-famille des protéines Rab régulent le transport vésiculaire durant le trafic membranaire. La sous-famille Rab-A, homologue de Ypt31/32 chez la levure et de Rab11 chez les animaux, est considérablement sophistiquée chez les plantes. Chez Arabidopsis, 26 des 57 protéines Rab prédites sont des membres de la famille des protéines Rab-A et peuvent donc êtres organisés en 6 sous-classes, de Rab-A1 à Rab-A6. Cette arborisation unique des protéines Rab-A chez les plantes suggère un mécanisme spécifique lié au dynamisme du trafic membranaire autour du réseau Trans-golgien (Trans-Golgi Network ou TGN). Rab-A1c strictement avec certain membres des familles Rab-A2 et Rab-A4, mais ne co-localise que partiellement avec VHA-a1-mRFP, marqueur du TGN, suggérant une restriction de cette protéine à une sous-population du TGN. Dans les cellules mitotiques, RAB-A1c est relocalisée au niveau de la plaque cellulaire en croissance. De manière intéressante, ce compartiment ainsi que la relocalisation de RAB-A1c à la plaque cellulaire pendant la mitose sont sensibles à l'endosidine 1 (ES1), un stabilisateur d'actine récemment identifié qui interrompt de façon sélective le recyclage de différentes protéines de la membrane cellulaire du TGN. De plus, malgré la redondance fonctionnelle entre les membres de la famille Rab-A1, les racines présentent un défaut de croissance dans les triples mutants rab-a1a/b/c, démontrant une hypersensibilité à ES1. Ce retard de croissance, causé par un défaut de mitose, contribue à l'hypersensibilité à ES1 dans les racines en formation. Finalement, les protéines Rab-A1 seraient donc sensibles à ES1 durant la cytokinese et joueraient un rôle important dans la régulation du trafic membranaire.Les protéines Rab, en tant que déclencheur moléculaire du trafic membranaire, sont régulées par les facteurs d'échange de guanine (GEFs). Chez la levure, TRAPII, un complexe protéique de 10 sous-unités (7 sous-unités partagées avec TRAPI incluant Trs20, Trs23, Trs31, Trs33, Trs85, Bet3 et Bet5, et 3 sous-unités spécifiques à TRAPII, appelées Trs65, Trs120 et Trs130) a été identifié comme étant le facteur GEF pour YPT31/32. En utilisant une approche combinant l'imagerie in vivo et la génétique, nous avons révélé que les mutants attrs120 et attrs130, codant deux des sous-unités spécifiques de TRAPII chez Arabidopsis, présentent des défauts de cytokinese semblable à une absence de polarité cellulaire. Dans ces mutants, les vésicules ainsi que les structures vésicule-tubules s'accumulent anormalement. Toutefois, le transport entre le Reticulum endoplasmique (RE) et le Golgi semble être normal. En utilisant secGFP comme marqueur de la sécrétion, j'ai démontré que le transport de cette protéine vers le TGN est inhibé dans les mutants attrs120 et attrs130. De plus, le recyclage de PIN2 et AUX1, mais pas celui de PIN1 est ralenti dans ce contexte mutant. J'ai démontré que AtTrs130-YFP co-localise parfaitement avec GFP-RAB-A1c dans la sous-population de TGN sensible à ES1. Cependant, dans les mutants attrs130, la majorité des protéines GFP-RAB-A1c est délocalisée vers cytoplasme. Dans les mutants attrs130, la surexpression de RAB-A1c(Q72L), constitutionnellement active, compense partiellement le phénotype de défaut de croissance des racines, contrairement à celle de RAB-D2a(Q67L). L'ensemble de ces résultats montre que TRAPII, chez Arabidopsis, pourrait être le facteur GEF en amont des protéines Rab-A1 dans le trafic membranaire post-golgien.

The netrin-1 receptor Deleted in Colorectal Cancer (DCC) acts as a tyrosine kinase-associated receptor to mediate the attractive response of the growth cone towards the source of netrin-1. Fyn phosphorylates DCC on tyrosine 1418 to trigger neurite formation. DCC function requires lipid rafts, but it is not known how lipid rafts regulate DCC signaling. The activity of the Rho family GTPases Rac1 and Cdc42 are required to mediate DCC-dependent neurite formation. Determining how lipid rafts regulate DCC signaling and where Rac1 and Cdc42 activity is in a cell relative to DCC would aid in understanding the complex mechanism by which DCC connects netrin-1 binding to polarized cytoskeletal remodeling and axon growth to guide the growth cone towards the netrin-1 source. In the first part of this thesis, we have demonstrated that while netrin-1 binds to DCC in lipid rafts at the cell surface, DCC targeting to lipid rafts is insensitive to netrin-1 addition. DCC is phosphorylated both in rafts and non-lipid rafts and its association with Fyn and activation of FAK are all detected outside of lipid rafts. Thus, we show that while netrin-1 binds to DCC in lipid rafts, subsequent signals are propagated outside of this compartment independently of DCC translocation out of lipid rafts. In the second part, we developed a methodology and analysis regimen to image active Rac1 and Cdc42 by using sensitized emission fluorescence resonance energy transfer (FRET) in living cells and compared the utility of using intermolecular versus intramolecular FRET-based biosensors in visualizing Rho GTPase activity. In the last part we combined the FRET-biosensors with DCC in optimal imaging environment of Hela cells and determined that DCC localized to an F-actin enriched compartment on the cell surface, along with Rac1 and Cdc42, that did not correspond to early, late, or recycling endosomes. ICY-Cdc42 revealed that DCC colocalized with active Cdc42 and induced a gradient of Cdc42 activity, wh / Le récepteur transmembranaire Deleted in Colorectal Cancer (DCC) agit comme un récepteur à activité tyrosine kinase pour arbitrer l'attraction du cône de croissance vers une source de protéines chémotropiques, les nétrines. Fyn phosphoryle DCC sur le résidu tyrosine en position 1418 et cette action est nécessaire pour déclencher la formation de neurites. Les domaines membranaires appelés « lipid rafts » sont requis pour la fonction de DCC mais la façon dont ces « rafts » régulent la signalisation de DCC est jusqu'à ce jour inconnue. L'activité des GTPases Rho, en particulier celles de Rac1 et Cdc42, est cruciale pour la croissance de neurites induite par DCC. Démontrer la manière dont les rafts régulent la signalisation de DCC ainsi que positionner les activités de Rac1 et Cdc42 dans la cellule par rapport à DCC pourrait aider à comprendre le mécanisme complexe par lequel la nétrine-1 agit via DCC afin de provoquer la réorganisation du cytoskelette et la croissance axonale qui permet de guider le cône de croissance vers une source de nétrine-1. Dans la première partie de cette thèse, nous avons démontré que la nétrine-1 se lie à DCC à la surface cellulaire dans les rafts mais que la relocalisation de DCC dans ces domaines membranaires était insensible à l'ajout additionnel de nétrine-1. La phosphorylation de DCC survient aussi bien à l'intérieur ou à l'extérieur des rafts mais son association avec Fyn et l'activation de Fak sont des événements qui ont été seulement observés à l'extérieur des rafts. Par conséquent, nous montrons que lorsque la nétrine-1 se lie à DCC dans les rafts, des signaux subséquents se propagent à l'extérieur de ces domaines, indépendamment de la translocation de DCC à l'extérieur de ces derniers. Dans la deuxième partie, nous avons développé une méthodologie et une façon analytique servant à imager les activités de Rac1 et Cdc42 dans les cellules vivantes en utilisant la te