A degradação lisossomal de proteínas de membrana endocitadas ocorre por meio do direcionamento destas proteínas para vesículas intralumenais (ILVs), formadas no lúmen dos corpos multivesiculares (MVBs), e subsequente fusão dos MVBs com lisossomos. Apesar de sua importância na degradação de proteínas transmembrana, os MVBs possuem outra importante função, a de produzir e liberar vesículas extracelulares (EVs). Neste processo os MVBs não se fundem com lisossomos, mas sim com a membrana plasmática o que resulta na liberação das vesículas residentes no interior dos MVBs para o meio extracelular. Diversas proteínas participam do direcionamento de cargas para os MVBs. Os estudos que delinearam a via de tráfego mediada por AP1 concentraram-se nos complexos contendo a subunidade ?1 que medeia o transporte de proteínas entre a rede trans-Golgi (TGN) e endossomos. Contudo, o genoma humano codifica uma segunda isoforma desta subunidade, denominada ?2, e evidências presentes na literatura e também observadas por nosso grupo indicam que AP1?2 pode regular uma via de tráfego distinta da via classicamente atribuída a AP1. Utilizando ensaios de uptake de EGF em condições onde foi realizado o KD de ?1 ou ?2, foi observado que o silenciamento de ?2 prejudica a degradação de EGF internalizado por seu receptor. Efeito também observado para o próprio receptor de EGF (EGFR) em ensaios de biotinilação da superfície celular. Demonstrando que a degradação lisossomal do complexo EGF-EGFR pela via canônica dos MVBs requer o complexo AP1?2, mas não AP1?1. Em conjunto com este estudo também foi analisado o mecanismo molecular de direcionamento da proteína Nef do HIV-1 para os MVBs associados a liberação de EVs. A proteína Nef do HIV é determinante na modulação do ambiente intracelular favorecendo a replicação do vírus e progressão à AIDS. Nef é ativamente secretado em EVs e sua liberação pode levar a apoptose de células vizinhas aceptoras dessas vesículas. Nef também medeia a redução dos níveis de CD4 e moléculas de MHC-I em EVs. Ainda não é conhecido o mecanismo molecular utilizado por Nef para ser exportado em EVs, mas sabe-se que Nef interage fisicamente com a proteína II acessória da maquinaria ESCRT, Alix, importante no processo de formação das ILVs e seleção das cargas que serão internalizadas nos MVBs. EVs coletadas de células HeLa e linfócitos T CD4+ silenciados para Alix demostraram reduções significativas na liberação de Nef. Estes resultados indicam que Nef requer Alix para sua eficiente liberação em EVs. / Lysosomal degradation of endocytosed membrane proteins occurs through the targeting of these proteins to intraluminal vesicles (ILVs), formed in the multivesicular bodies (MVBs) lumen, and the subsequent fusion of MVBs with lysosomes. Despite its importance in the degradation of transmembrane proteins, MVBs have another important function, the production and release of extracellular vesicles (EVs). In this process, the MVBs do not fuse with lysosomes, but fuse with the plasma membrane resulting in the release of these vesicles that reside within MVBs to the extracellular environment. Several proteins regulate the targeting of cargo to MVBs. Studies that delineated the functions of AP1 in protein trafficking, focused on complexes containing the ?1 subunit, which mediates transport between trans-Golgi network (TGN) and endosomes. However, the human genome encodes a second isoform of this subunit, named ?2. Evidences from the literature, as well as results from our research group, indicate that AP1?2 regulates transport pathways that are distinct from the pathways classically attributed to AP1. By performing EGF-uptake assays under ?1 or ?2 knockdown (KD) conditions, it was observed that ?2 is required for degradation of internalized EGF, effect also observed for the EGF receptor (EGFR) using cell surface biotinylation assays. These results demonstrate that the lysosomal degradation of the EGFEGFR complexes via the canonical MVBs pathway requires the AP1?2 complex, but not AP1?1. In parallel with this study, we also analyzed the molecular mechanism of HIV-1 Nef targeting to MVBs associated with the EVs release. Nef is an important determinant in the modulation of the intracellular environment for efficient HIV replication and progression to AIDS. Nef is actively secreted via EVs and its release may lead to apoptosis of bystander acceptor cells. Moreover, Nef reduces the levels of CD4 and MHC-I molecules in EVs. Despite the importance of Nef release in EVs, the molecular mechanism used by Nef to be exported via EVs is unknown. Nef physically interacts with the ESCRT machinery accessory protein Alix, an important player in the process of ILVs formation and cargo selection. EVs released from HeLa cells and CD4+ T lymphocytes under Alix KD conditions demonstrated a significant IV reduction in Nef release via EVs. These results indicate that Nef requires Alix for its efficient release in EVs.

A degradação lisossomal de proteínas de membrana endocitadas ocorre por meio do direcionamento destas proteínas para vesículas intralumenais (ILVs), formadas no lúmen dos corpos multivesiculares (MVBs), e subsequente fusão dos MVBs com lisossomos. Apesar de sua importância na degradação de proteínas transmembrana, os MVBs possuem outra importante função, a de produzir e liberar vesículas extracelulares (EVs). Neste processo os MVBs não se fundem com lisossomos, mas sim com a membrana plasmática o que resulta na liberação das vesículas residentes no interior dos MVBs para o meio extracelular. Diversas proteínas participam do direcionamento de cargas para os MVBs. Os estudos que delinearam a via de tráfego mediada por AP1 concentraram-se nos complexos contendo a subunidade ?1 que medeia o transporte de proteínas entre a rede trans-Golgi (TGN) e endossomos. Contudo, o genoma humano codifica uma segunda isoforma desta subunidade, denominada ?2, e evidências presentes na literatura e também observadas por nosso grupo indicam que AP1?2 pode regular uma via de tráfego distinta da via classicamente atribuída a AP1. Utilizando ensaios de uptake de EGF em condições onde foi realizado o KD de ?1 ou ?2, foi observado que o silenciamento de ?2 prejudica a degradação de EGF internalizado por seu receptor. Efeito também observado para o próprio receptor de EGF (EGFR) em ensaios de biotinilação da superfície celular. Demonstrando que a degradação lisossomal do complexo EGF-EGFR pela via canônica dos MVBs requer o complexo AP1?2, mas não AP1?1. Em conjunto com este estudo também foi analisado o mecanismo molecular de direcionamento da proteína Nef do HIV-1 para os MVBs associados a liberação de EVs. A proteína Nef do HIV é determinante na modulação do ambiente intracelular favorecendo a replicação do vírus e progressão à AIDS. Nef é ativamente secretado em EVs e sua liberação pode levar a apoptose de células vizinhas aceptoras dessas vesículas. Nef também medeia a redução dos níveis de CD4 e moléculas de MHC-I em EVs. Ainda não é conhecido o mecanismo molecular utilizado por Nef para ser exportado em EVs, mas sabe-se que Nef interage fisicamente com a proteína II acessória da maquinaria ESCRT, Alix, importante no processo de formação das ILVs e seleção das cargas que serão internalizadas nos MVBs. EVs coletadas de células HeLa e linfócitos T CD4+ silenciados para Alix demostraram reduções significativas na liberação de Nef. Estes resultados indicam que Nef requer Alix para sua eficiente liberação em EVs. / Lysosomal degradation of endocytosed membrane proteins occurs through the targeting of these proteins to intraluminal vesicles (ILVs), formed in the multivesicular bodies (MVBs) lumen, and the subsequent fusion of MVBs with lysosomes. Despite its importance in the degradation of transmembrane proteins, MVBs have another important function, the production and release of extracellular vesicles (EVs). In this process, the MVBs do not fuse with lysosomes, but fuse with the plasma membrane resulting in the release of these vesicles that reside within MVBs to the extracellular environment. Several proteins regulate the targeting of cargo to MVBs. Studies that delineated the functions of AP1 in protein trafficking, focused on complexes containing the ?1 subunit, which mediates transport between trans-Golgi network (TGN) and endosomes. However, the human genome encodes a second isoform of this subunit, named ?2. Evidences from the literature, as well as results from our research group, indicate that AP1?2 regulates transport pathways that are distinct from the pathways classically attributed to AP1. By performing EGF-uptake assays under ?1 or ?2 knockdown (KD) conditions, it was observed that ?2 is required for degradation of internalized EGF, effect also observed for the EGF receptor (EGFR) using cell surface biotinylation assays. These results demonstrate that the lysosomal degradation of the EGFEGFR complexes via the canonical MVBs pathway requires the AP1?2 complex, but not AP1?1. In parallel with this study, we also analyzed the molecular mechanism of HIV-1 Nef targeting to MVBs associated with the EVs release. Nef is an important determinant in the modulation of the intracellular environment for efficient HIV replication and progression to AIDS. Nef is actively secreted via EVs and its release may lead to apoptosis of bystander acceptor cells. Moreover, Nef reduces the levels of CD4 and MHC-I molecules in EVs. Despite the importance of Nef release in EVs, the molecular mechanism used by Nef to be exported via EVs is unknown. Nef physically interacts with the ESCRT machinery accessory protein Alix, an important player in the process of ILVs formation and cargo selection. EVs released from HeLa cells and CD4+ T lymphocytes under Alix KD conditions demonstrated a significant IV reduction in Nef release via EVs. These results indicate that Nef requires Alix for its efficient release in EVs.