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Expressão heteróloga da EMA-2 de Theileria equi em Pichia pastoris / Heterologous Expression of Theileria equi EMA-2 protein in Pichia pastoris.

Vianna, Ana Muñoz 25 July 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ana_munhoz_vianna.pdf: 719262 bytes, checksum: c1b68d796b66c4c6c3d0037b6024cb3d (MD5) Previous issue date: 2011-07-25 / The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is considered one of the most important equine diseases in both tropical and subtropical countries. Theileriosis is endemic in Brazil and causes significant economic losses for equine breeders. Disease-free countries restrict horse transit coming from endemic areas due to the high prevalence of asymptomatic carrier animals. In order to prevent and control this disease, it is therefore necessary to develop efficient diagnostic methods. Previous Theileria equi immunological diagnostic studies have been based in outer membrane antigens. Equi merozoite antigen (EMA) is a major outer membrane antigen of this protozoan, recognized by antibodies of Theileria equi positive horses. In this study, we reported the expression, purification and characterization of EMA-2 protein of Theileria equi in the yeast Pichia pastoris. The EMA-2 gene was cloned into the expression vector pPICZαB and the expressed protein was secreted to the medium as a soluble form. The expression and antigenicity of rEMA-2 protein was demonstrated by Dot and Western Blotting, using anti-histidine and equine Theileriosis clinically positive antibodies. An indirect ELISA with the rEMA-2 was performed and it was possible to differentiate with more than a threefold difference between negative and positive serum from horses confirmed with Theileriosis. The data obtained in this work suggest that the rEMA-2 protein expressed in P. pastoris is a potential candidate for use as antigen in immunodiagnostic of T. equi. / A Piroplasmose equina causada por Theileria equi é considerada uma das mais importantes doenças dos equinos em regiões tropicais e subtropicais. Acomete os equinos de forma endêmica no Brasil levando a significativas perdas econômicas. Países livres da doença não permitem a entrada de animais provindos de regiões endêmicas devido à alta prevalência de animais assintomáticos. Para controle e prevenção desta enfermidade se faz necessário desenvolvimento de métodos de diagnóstico eficazes. Os estudos sobre o diagnóstico imunológico para Theileriose concentram-se em antígenos da membrana externa. O principal antígeno da membrana externa deste protozoário, Equi Antígeno Merozoite (EMA) é reconhecido por anticorpos de cavalos positivos para Theileria equi. Neste estudo reportamos a expressão, purificação e a caracterização da proteína EMA-2 de Theileria equi na levedura Pichia pastoris. O gene EMA-2 foi clonado no vetor de expressão pPICZαB sendo a proteína expressa, secretada de forma solúvel ao meio. A expressão e antigenicidade da proteína rEMA-2 foi demonstrado por Dot e Western Blotting utilizando-se anti-histidina e anticorpos de equinos clinicamente positivos para Theileriose. Um ELISA indireto com rEMA-2 foi realizado e foi possível determinar uma diferença de mais de três vezes entre os soros de equinos confirmados como positivos e negativos para Theileriose. Com os dados obtidos neste trabalho podemos sugerir que a proteína rEMA-2 é um potencial candidato para ser utilizado como antígeno em imunodiagnóstico de T. equi.

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