La symbiose ectomycorhizienne se définie comme une association mutualiste entre les racines des plantes ligneuses et le mycélium de champignons du sol. Elle est majoritaire dans les écosystèmes forestiers de l'hémisphère nord et permet l'amélioration de la nutrition hydrominérale des plantes ligneuses, notamment lorsque la disponibilité en ressources se fait rare. Des données transcriptomiques et génomiques du champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum ont permis d'identifier différents gènes codant pour des protéines capables de transporter des nutriments. L'implication éventuelle de ces systèmes de transport dans la nutrition potassique et phosphatée ectomycorhize-dépendante de la plante hôte Pinus pinaster reste à évaluer. Dans cette étude, deux gènes candidats codant pour des systèmes de transport de potassium (K+), HcTrk1 et HcSKC, et deux autres pour des transporteurs de phosphate inorganique (Pi), HcPT1.1 et HcPT2, ont été analysés. Des approches permettant la localisation dans l'ectomycorhize des transcrits (hybridation in situ) et des protéines (fusion traductionnelle) de ces candidats ont été générés. Ces différents outils ont permis de montrer que le transporteur HcTrk1 et le canal HcSKC étaient respectivement localisés dans l'ectomycorhize au niveau des sites de prélèvement et de relargage du K+. D'autre part, des lignées transgéniques d'H. cylindrosporum sur- et/ou sous-exprimant ces gènes ont été produites afin de voir si la nutrition végétale en K+ et en Pi était impactée. Ainsi, l'utilisation en mycorhization de lignées surexprimant HcTrk1 et sous-exprimant HcSKC ont montré une diminution de la nutrition potassique et de l'homéostasie du phosphore de la plante hôte. Les mêmes types d'approches ont été utilisés avec les transporteurs de Pi HcPT1.1 et HcPT2. En utilisant des lignées transgéniques, il a ainsi pu être montré que la surexpression de HcPT1.1 en condition carencée décrite précédemment était liée à l'activité de son promoteur. Quant au transporteur HcPT2, des analyses préliminaires de localisation suggèrent qu'il pourrait être impliqué dans le prélèvement de Pi du sol et dans son relargage au niveau du réseau de Hartig. Des études complémentaires restent cependant à mener. Enfin, cinq autres systèmes de transport de K+ et trois de phosphate ont été récemment identifiés à partir du génome d'H. cylindrosporum, ouvrant la voie à la dissection fine des mécanismes moléculaires régissant la nutrition potassique et phosphatée ectomycorhize dépendante de P. pinaster. / Ectomycorrhizal symbiosis is defined as a mutual association between the roots of woody plants and the mycelium of soil fungi. This symbiosis is widespread in northern forests and plays a major role in nutrient and water uptake of woody plants, especially when resources become scarce. Transcriptomic and genomic data of the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum allowed the identification of several genes coding for nutrient transport proteins. Their putative involvement in ectomycorrhiza-dependent potassium and phosphate nutrition of the host plant Pinus pinaster needs to be assessed. In this study, two candidate genes coding for potassium (K+) transport systems, HcTrk1 and HcSKC, and two other genes coding for inorganic phosphate (Pi) transporters, HcPT1.1 and HcPT2, were analyzed. Molecular approaches allowing the localization of transcripts (in situ hybridization) and proteins (translational fusion) of these candidates in ectomycorrhiza were obtained. These tools allowed us to show that the HcTrk1 transporter and the HcSKC channel were localized in K+ uptake and release sites of the ectomycorrhiza, respectively. In order to know whether these proteins play a role in plant K+ and Pi nutrition, H. cylindrosporum transgenic lines with up- and/or down-regulated expression of candidate genes were produced. In mycorrhizal assays, the use of fungal strains with up- or down- regulated expression of HcTrk1 and HcSKC, respectively, affects the K+ nutrition and phosphorus homeostasis of the host plant. The same approaches were used for HcPT1.1 and HcPT2 Pi transporters. Therefore, using transgenic strategies, we demonstrated that the previously shown up-regulation of HcPT1.1 expression under Pi shortage is related to its promoter activity. Concerning HcPT2, preliminary localization analysis suggested that this transporter might be involved in Pi uptake from soil and in release in the Hartig net. However, complementary studies are needed. Five and three novel K+ and Pi transport systems, respectively, were identified from the recent genome accession of H. cylindrosporum, opening the way to a fine dissection of molecular mechanisms controlling the ectomycorrhiza-dependent K+ and phosphate nutrition of Pinus pinaster.

Les microorganismes agissent comme un puits et une source de N et Pdisponibles car ils sont responsables des cycles biogéochimiques de N et P. La bouclemicrobienne, basée sur la prédation des bactéries par les microprédateurs tels que lesnématodes bactérivores, est considérée comme un facteur majeur de la minéralisation de Net de P dans les écosystèmes terrestres. Cependant, peu de données sont disponibles surl'impact de la prédation par les nématodes sur la nutrition minérale des plantes ligneusesectomycorhizées. Différentes expérimentations ont été conduites pour quantifier le rôle dela prédation des bactéries par les nématodes sur l'architecture et la croissance racinaire, lanutrition minérale (N et P) d'une espèce ligneuse, Pinus pinaster, associée ou non avec lebasidiomycète ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum. Les plantes ont été cultivéesdans un système expérimental simplifié et stérile, et inoculées ou non avec Bacillus subtiliset des nématodes bactérivores (de la famille des Rhabditidae ou des Cephalobidae) isolés àpartir d'ectomycorhizes et de sol provenant d'une plantation de Pin maritime. L'effet de laprédation sur la croissance des plantes et le devenir du 15N bactérien vers les partiesaériennes dépend très fortement de la disponibilité en P du milieu. De plus, la prédationdes bactéries est indispensable pour permettre à la plante d'utiliser le P du phytate, unesource de P organique très peu disponible pour la plante mais très facilement utilisable parB. subtilis car cette bactérie est capable de libérer de la phytase dans le milieu. Cesrésultats ouvrent de nouvelles perspectives pour améliorer l'utilisation du phytate pour lanutrition phosphatée des plantes. / Soil microorganisms act as a sink and a source of available N and P bymediating key processes in the biogeochemical N and P cycling. The microbial loop, basedupon the grazing of bacteria by predators such as bacterial-feeding nematodes, is thoughtto play a major role in the mineralization of nutrients such as nitrogen (N) and phosphorus(P) in terrestrial ecosystems. However, little is known about the impact of grazing bynematodes on mineral nutrition of ectomycorrhizal woody plants. Different studies wereundertaken to quantify the role of nematode grazing on bacteria on the root growth andarchitecture, mineral nutrition (N and P) of a woody species, Pinus pinaster, whether ornot associated with the ectomycorrhizal basidiomycete Hebeloma cylindrosporum. Plantswere grown in a sterile simplified experimental system, whether inoculated or not withBacillus subtilis and bacterial-feeding nematodes (belonging to Rhabditidae orCephalobidae families) that were isolated from ectomycorrhizae and from soil of a P.pinaster plantation. The effect of nematode grazing on plant growth and the fate ofbacterial 15N towards plant shoots was strongly dependent upon medium P availability. Inaddition, nematode grazing was required to enable the plant to access P from phytate, awell-known poorly available P source to plants but that was used by bacterial populationsof B. subtilis due to its ability to release phytase in the medium. These results open analternative route to increase the use of phytate for plant P nutrition.

La symbiose ectomycorhizienne, répandue dans les forêts tempérées et boréales, se base sur des échanges nutritionnels entre la plante hôte et des champignons du sol. Ce mutualisme améliore la nutrition minérale et en eau de plantes ligneuses à travers des mécanismes encore méconnus. Ce manuscrit de thèse présente l’ensemble des systèmes de transport membranaire du champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum identifié à partir du génome séquencé, avec un accent sur les gènes dont l’expression est induite en symbiose avec son hôte naturel, le pin maritime (Pinus pinaster). Ces données aideront à focaliser les futures recherches sur les gènes qui sont induits par la symbiose. Le champignon H. cylindrosporum améliore la nutrition potassique de son hôte en situation de carence. Cette étude est axée sur trois canaux ioniques qui peuvent être impliqués dans le transfert de K+ vers la plante. Ces canaux appartiennent à la famille TOK (Tandem-pore Outward-rectifying K+), spécifique de champignons et ont été caractérisés par plusieurs approches expérimentales. Des analyses in silico ont déterminé que ces trois canaux appartiennent à deux sous-familles et ont été nommés HcTOK1, HcTOK2.1 et HcTOK2.2. Leurs propriétés fonctionnelles ont été caractérisées par expression hétérologue pour une analyse en voltage-clamp à deux électrodes et complémentation de levures. La localisation a été étudiée par hybridation in situ en mycorhizes et par fusions gène-eGFP exprimés chez la levure et chez H. cylindrosporum. Le rôle physiologique des canaux HcTOK a été testé en culture pure et en symbiose avec P. pinaster grâces à des lignées transgéniques surexprimant ces gènes. En plus, les effets de la mycorhization par H. cylindrosporum et la nutrition potassique ont été testés chez P. pinaster cultivé en conditions de stress salin. Dans un premier temps, la tolérance du champignon au stress salin a été vérifiée en culture pure, ainsi que l’élément toxique de ce stress. Ensuite, le champignon a été cultivé en deux conditions de nutrition potassique et quatre de salinité pour connaître son homéostasie du K+ et analyser l’expression de ses systèmes de transport. Finalement, des plantules de P. pinaster ont été cultivées inoculées ou non en deux conditions de K+ et quatre de stress salin. En résumé, l’analyse de trois canaux HcTOK ont permis de démontrer les spécificités pour les sous-familles TOK1 et TOK2 et ont suggéré que HcTOK2.2 est probablement un élément clé pour le transfert du K+ via la plante en mycorhize. H. cylindrosporum semble jouer un rôle dans la tolérance à la salinité du pin maritime en diminuant le transfert du Na+ vers la plante et améliorant la nutrition potassique. / The ectomycorrhizal symbiosis, widespread in temperate and boreal ecosystems, is based in nutritional exchanges between the host plant and soil-borne fungi. This mutualism improves plant mineral and water nutrition of woody plants through mechanisms that are still largely unknown. This manuscript presents the whole set of membrane transport systems of the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum identified from the sequenced genome, with an emphasis on the genes that are up-regulated in symbiosis with its natural host, the maritime pine (Pinus pinaster). These data will help to focalize future research on symbiosis-induced genes. The fungus H. cylindrosporum enhances the potassium (K+) nutrition of P. pinaster under starvation. This study has focused on three ion channels that could transfer the K+ to the plant. These channels belong to the fungal-specific TOK (Tandem-pore Outward-rectifying K+) family and have been characterized using several approaches. In silico analyses have positioned them in two subfamilies, giving them the names HcTOK1, HcTOK2.1 and HcTOK2.2. Their functional activity has been characterized by heterologous expression for two-electrode voltage-clamp measurements and yeast complementation. Localization has been studied by in situ hybridization in mycorrhiza and by expression of gene-eGFP constructs in yeast and H. cylindrosporum. The physiological role of these channels has been tested in pure culture and symbiosis with transgenic fungal lines overexpressing the HcTOK channels. Furthermore, the effects of H. cylindrosporum and K+ nutrition have been tested in P. pinaster seedlings subjected to salt stress. First, the tolerance to salinity of the fungus was analysed in pure culture with different compounds to identify the most toxic component. Second, the fungus was cultured in different NaCl and K+ conditions to know whether it kept the homeostasis and to check the expression of K+ transport systems. Finally, P. pinaster seedlings were cultured inoculated or not in two different K+ nutrition and four salinity conditions. Altogether, analysis of the three HcTOK channels revealed specificities of the TOK1- and TOK2-type and suggested that HcTOK2.2 might be a main player for the K+ transfer from the fungus towards the plant. H. cylindrosporum seems to play a role in the tolerance to salt stress of the maritime pine by reducing the Na+ transfer to the plant and improving K+ nutrition.