De part leur importance médicale, leur capacité à évoluer et leur facilité de manipulations, les bêta-lactamases TEM-1 et plus récemment CTX-M-15, se sont imposées comme des modèles de biochimie mais aussi des modèles pour une étude évolutive des protéines. La caractérisation de la distribution de l'effet des mutations dans une protéine permet d'avancer dans la compréhension des mécanismes moléculaires et des contraintes influant sur l'évolution des gènes de résistance aux antibiotiques et de façon plus globale sur les protéines.Par une approche de mutagénèse exhaustive suivie d’une évolution expérimentale sous sélection antibiotique couplée à du séquençage à haut débit, nous avons pu déterminer et décrire la distribution des effets des mutations dans la protéine TEM-1. Trois catégories de mutants ont été identifiées comme ayant des comportements différents en termes de cinétique de mort face à l'antibiotique. Des études phénotypiques ont permis de proposer un scénario impliquant une saturation progressive des principales protéines liant la pénicilline en fonction de l’activité hydrolytique du mutant de bêta-lactamase. Enfin, un modèle biochimique qualitatif compatible avec cette cinétique est proposé. La comparaison des effets des mutations entre TEM-1 et CTX-M-15, deux bêta-lactamases de la famille des sérines protéases de classe A et homologue à 30%, permet d’étudier la notion de contexte-dépendance des mutations. Notamment, à travers le résidu 251 qui est différent entre ces 2 protéines et intolérant aux mutations, nous replaçons cette problématique dans une perspective évolutive globale. Cela nous permet d’étudier les incompatibilités mutationnelles au sein des protéines et les possibilités de compensation des sites destabilisés. Nous observons une compensation à la fois globale, au travers de l’effet sur la stabilité, mais aussi locale avec une épistasie forte entre le résidu 251 et le site compensateur. Enfin, afin d’étudier de façon exhaustive les intéractions épistatiques dans les protéines, nous nous sommes focalisés sur une hélice alpha de la protéine TEM-1. L’étude de près de 73% des 22000 combinaisons mutationnelles possibles a permis de souligner l’importance de la stabilité thermodynamique, celle-ci expliquant une grande part des effets des mutations. Cependant, un contingent d’interactions ne semble pas expliquable par ce modèle ce qui montre l’importance des interactions locales au sein des hélices. Le couplage de ces approches évolutives quantitatives et mécanistiques permettent à la fois d’avancer dans la compréhension des contraintes qui sous-tendent l’évolution des protéines mais aussi de plonger au cœur de la résistance aux antibiotiques et de ses mécanismes moléculaires. / Beta-lactamases TEM-1 and more recently CTX-M-15 are antibiotic resistance enzymes that combine a medical importance, a fast evolution in the wild and are easy amenable to manipulation in the laboratory. As such, they have become models of biochemistry and also models for the study of protein evolution. The characterization of the distribution of mutational effect within a protein shed light on the molecular mechanisms and the constraints influencing the evolution of proteins.Using an exhaustive mutagenesis approach followed by an experimental evolution under antibiotic selection coupled with high-throughput sequencing, we were able to determine and describe the distribution of the effects of mutations in the TEM-1 protein. Three categories of mutants have been identified as having different behaviors in terms of survival kinetics when facing the antibiotic. Phenotypic studies have allowed us to propose a scenario involving a progressive saturation of the main penicillin-binding proteins as a function of the hydrolytic activity of the beta-lactamase mutant. Finally, a qualitative biochemical model compatible with this kinetic is proposed.I then compared the fitness effects of mutations in TEM-1 and CTX-M-15, which are two beta-lactamases of the class A serine protease family with 30% homology. I focused on the context dependency of mutation effects and concentrated my analysis on residue 251, which harbor a different aminoacid in each of the enzyme that is not functional when inserted in the other protein. I further studied how mutations in the rest of the protein could compensate that incompatibility. Compenstation was found to be associated to mutations acting presumably through on overall effect on protein stability, and on some cases to some local interactions with residue 251.Finally, in order to study exhaustively the epistatic interactions in proteins, we focused one alpha helix of TEM-1. The study of nearly 73% of the 22,000 possible mutational combinations made it possible to underline the importance of thermodynamic stability, which explains a large part of the effects of mutations. However, a contingent of interactions does not seem to be explained by this model, which shows the importance of the local interactions within the helices.The coupling of these quantitative and mechanistic evolutive approaches makes it possible both to advance in understanding the constraints underlying the evolution of proteins but also to plunge into the heart of resistance to antibiotics and its molecular mechanisms.

Cette thèse porte sur le décryptage des causes des variations des taux de substitution moléculaires entre lignées. D'un point de vue théorique, différentes hypothèses sont souvent basées sur des distributions des valeurs sélectives des mutations assez simplistes. En utilisant le modèle géométrique de Fisher, nous avons pu dériver des expressions pour cette distribution, et mettre en évidence l'importance de la complexité phénotypique et de la pléiotropie des mutations. Les variations entre espèces de la proportion de changements d'amino-acides qui sont adaptatifs sont souvent interprétées comme une conséquence de différences de taille de population. Par des simulations, nous avons démontré que la taille efficace des populations n'a qu'une influence faible sur la variation de ces taux, et que les changements environnementaux et la complexité phénotypique peuvent avoir un effet plus important. En ce qui concerne les taux de substitution synonymes, une relation inverse avec la masse corporelle est souvent décrite chez les vertébrés endothermes. Pour déterminer si cette relation est aussi valable chez les vertébrés ectothermes, nous avons suivi une approche comparative portant sur les tortues. Nous avons estimé les taux de substitution synonymes chez 224 espèces, que nous avons ensuite comparé à la masse corporelle (et autres traits d'histoire de vie) et à une variable environnementale (la latitude). Nos résultats démontrent que les taux d'évolution moléculaires sont fortement corrélés aux conditions environnementales et non pas à des traits d'histoire de vie. / The main objective of the present thesis is to elucidate the causes of variations in rates of molecular evolution among lineages, and in particular, to understand how factors connected to mutation, selection and genetic drift can influence these variations.

La dynamique structurelle des biomolécules est intimement liée à leur fonction, mais très coûteuse à étudier expériementalement. Pour cette raison, de nombreuses méthodologies computationnelles ont été développées afin de simuler la dynamique structurelle biomoléculaire. Toutefois, lorsque l'on s'intéresse à la modélisation des effects de milliers de mutations, les méthodes de simulations classiques comme la dynamique moléculaire, que ce soit à l'échelle atomique ou gros-grain, sont trop coûteuses pour la majorité des applications. D'autre part, les méthodes d'analyse de modes normaux de modèles de réseaux élastiques gros-grain (ENM pour "elastic network model") sont très rapides et procurent des solutions analytiques comprenant toutes les échelles de temps. Par contre, la majorité des ENMs considèrent seulement la géométrie du squelette biomoléculaire, ce qui en fait de mauvais choix pour étudier les effets de mutations qui ne changeraient pas cette géométrie. Le "Elastic Network Contact Model" (ENCoM) est le premier ENM sensible à la séquence de la biomolécule à l'étude, ce qui rend possible son utilisation pour l'exploration efficace d'espaces conformationnels complets de variants de séquence. La présente thèse introduit le pipeline computationel ENCoM-DynaSig-ML, qui réduit les espaces conformationnels prédits par ENCoM à des Signatures Dynamiques qui sont ensuite utilisées pour entraîner des modèles d'apprentissage machine simples. ENCoM-DynaSig-ML est capable de prédire la fonction de variants de séquence avec une précision significative, est complémentaire à toutes les méthodes existantes, et peut générer de nouvelles hypothèses à propos des éléments importants de dynamique structurelle pour une fonction moléculaire donnée. Nous présentons trois exemples d'étude de relations séquence-dynamique-fonction: la maturation des microARN, le potentiel d'activation de ligands du récepteur mu-opioïde et l'efficacité enzymatique de l'enzyme VIM-2 lactamase. Cette application novatrice de l'analyse des modes normaux est rapide, demandant seulement quelques secondes de temps de calcul par variant de séquence, et est généralisable à toute biomolécule pour laquelle des données expérimentale de mutagénèse sont disponibles. / The dynamics of biomolecules are intimately tied to their functions but experimentally elusive, making their computational study attractive. When modelling the effects of thousands of mutations, time-stepping methods such as classical or enhanced sampling molecular dynamics are too costly for most applications. On the other hand, normal mode analysis of coarse-grained elastic network models (ENMs) provides fast analytical dynamics spanning all timescales. However, the vast majority of ENMs consider backbone geometry alone, making them a poor choice to study point mutations which do not affect the equilibrium structure. The Elastic Network Contact Model (ENCoM) is the first sequence-sensitive ENM, enabling its use for the efficient exploration of full conformational spaces from sequence variants. The present work introduces the ENCoM-DynaSig-ML computational pipeline, in which the ENCoM conformational spaces are reduced to Dynamical Signatures and coupled to simple machine learning algorithms. ENCoM-DynaSig-ML predicts the function of sequence variants with significant accuracy, is complementary to all existing methods, and can generate new hypotheses about which dynamical features are important for the studied biomolecule's function. Examples given are the maturation efficiency of microRNA variants, the activation potential of mu-opioid receptor ligands and the effect of point mutations on VIM-2 lactamase's enzymatic efficiency. This novel application of normal mode analysis is very fast, taking a few seconds CPU time per variant, and is generalizable to any biomolecule on which experimental mutagenesis data exist.