Cette thèse décrit différentes stratégies pour co-immobiliser au sein d'un film sol-gel une déhydrogénase, le cofacteur NAD+/NADH et un système pour régénérer électrochimiquement ce cofacteur. L'immobilisation de la déshydrogénase dans la matrice sol-gel a été obtenue en utilisant un polyélectrolyte positivement chargé comme additif dans le sol de départ. Le film peut être déposé par les procédés d'évaporation ou d'électrogénération, permettant alors la fonctionnalisation d'électrodes d'or macroporeuses. La diaphorase a également pu être co-encapsulée pour la régénération du cofacteur NAD+. L'immobilisation du cofacteur a ensuite été obtenue par couplage chimique du NAD+ avec le groupement époxy du glycidoxypropylsilane avant formation du film. Plusieurs stratégies d'immobilisation du médiateur électrochimique ont alors été étudiées avec succès. Les espèces de type ferrocène ou des complexes d'osmium(III) peuvent être incorporées dans la matrice sol-gel par encapsulation de polymères portant ces médiateurs (Fc-PEI et polymère d'osmium) ou par co-condensation avec un ferrocène fonctionnalisé par un groupement silane. Finalement d'autres stratégies ont été étudiées basées sur la fonctionnalisation de nanotubes de carbone par un traitement micro-onde, par électropolymérisation du vert de méthylène, ou par recouvrement par un polymère de type acrylate portant des complexes d'osmium(III). L'électrogénération d'une couche mince sol-gel servant à immobiliser les protéines et le cofacteur à la surface des nanotubes fonctionnalisés par le polymère d'osmium(III) a alors permis d'observer une réponse électrocatalytique de stabilité remarquable. / In this thesis, the research work was focused on designing functional layers based on silica sol-gel thin films to co-immobilize dehydrogenase, cofactor and electron mediator to get the most highly active systems. Immobilization of dehydrogenase in an active form in a sol-gel matrix was obtained by using a positively-charged polyelectrolyte as additive in the starting sol. The optimal sol can be deposited by evaporation or by electrodeposition and was successfully deposited in macroporous electrodes. The immobilization of the cofactor was investigated by simple entrapment, adsorption to carbon nanotube (CNTs), encapsulation of NAD+ chemically attached to dextran(NAD-dextran), and by in-situ coupling with glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPS). The last approach allowed stable immobilization of the cofactor. Several mediators (Fc-PEI, Fc-Silane or Osmium polymer) were successfully co-immobilized with dehydrogenase and cofactor in the sol-gel matrix deposited by drop-coating. However, such co-immobilization did not operate in the electrogenerated sol-gel films. The strategies based on CNTs for mediator immobilization were finally developed. They include (1) micro-wave treatment (MWCNTs-µW), (2) electrochemical deposition of poly(methylene green) (MWCNTs-PMG), and (3) wrapping by osmium(III) polymer (MWCNTs-Os). MWCNTs-Os has been the only system that was successfully combined with sol-gel electrodeposition for co-immobilization of dehydrogenase and cofactor.