Aufgabe des Projektes war die Entwicklung einer neuen Technologie zur Probenpräparation für die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) auf der Basis der Ionenfeinstrahlbearbei-tung. Dazu wurden Prozesse der ionenstrahlgestützten Abtragung (Sputtern), der Abschei-dung, des Probenhandling sowie systemeigener Komponenten untersucht. Als Alternative zur Ga- Quelle wurde eine Flüssigmetall-Ionenquelle auf der Basis einer AuGeSi Legierung entwi-ckelt, charakterisiert und in der FIB 4400 eingesetzt. Um eine automatische Bearbeitung bei der Herstellung von TEM-Lamellen zu ermöglichen, erfolgte eine Modifikation der FIB-4400 Software. Das LabView Programm wurde entsprechend modifi-ziert und zusätzlich um nützliche Komponenten ergänzt. Abtragsraten auf der Basis der Volumenverlustmethode wurden experimentell bestimmt. Diese Werte dienen als Ausgangspunkt für eine weiter ausbaubare Datensammlung, die die entwi-ckelte Prozessautomatisierung verfeinert. Für den Tranfer von TEM -Lamellen, die aus dem Volumen präpariert werden, wurde ein spe-zieller lift-off Manipulator entwickelt, gebaut und getestet. Es wurde ein Angebotskatalog erarbeitet, der anhand von Applikationsbeispielen mit verschie-denen Anforderungen (raue Oberflächen, Hochauflösung, poröse Materialien, Materialien mit verminderter Leitfähigkeit) die Kooperationsmöglichkeiten im Dresdener Raum im Rahmen des Materialforschungsverbundes aufzeigt.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--Darmstadt.

Techn. Universiẗat, Diss., 2000--Berlin.

Techn. Universiẗat, Diss., 2001--Berlin.

Techn. University, Diss., 2002--Dresden.

Universiẗat, Diss., 2002--Tübingen.

Aufgabe des Projektes war die Entwicklung einer neuen Technologie zur Probenpräparation für die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) auf der Basis der Ionenfeinstrahlbearbei-tung. Dazu wurden Prozesse der ionenstrahlgestützten Abtragung (Sputtern), der Abschei-dung, des Probenhandling sowie systemeigener Komponenten untersucht. Als Alternative zur Ga- Quelle wurde eine Flüssigmetall-Ionenquelle auf der Basis einer AuGeSi Legierung entwi-ckelt, charakterisiert und in der FIB 4400 eingesetzt. Um eine automatische Bearbeitung bei der Herstellung von TEM-Lamellen zu ermöglichen, erfolgte eine Modifikation der FIB-4400 Software. Das LabView Programm wurde entsprechend modifi-ziert und zusätzlich um nützliche Komponenten ergänzt. Abtragsraten auf der Basis der Volumenverlustmethode wurden experimentell bestimmt. Diese Werte dienen als Ausgangspunkt für eine weiter ausbaubare Datensammlung, die die entwi-ckelte Prozessautomatisierung verfeinert. Für den Tranfer von TEM -Lamellen, die aus dem Volumen präpariert werden, wurde ein spe-zieller lift-off Manipulator entwickelt, gebaut und getestet. Es wurde ein Angebotskatalog erarbeitet, der anhand von Applikationsbeispielen mit verschie-denen Anforderungen (raue Oberflächen, Hochauflösung, poröse Materialien, Materialien mit verminderter Leitfähigkeit) die Kooperationsmöglichkeiten im Dresdener Raum im Rahmen des Materialforschungsverbundes aufzeigt.

Herzkreislauferkrankungen sind weit verbreitet und nicht nur eine große Belastung für die Betroffenen, sondern auch für das Gesundheitssystem. Die Folgen von Herzkreislauferkrankungen wie z.B. Myokardinfarkt und koronare Herzkrankheit stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Prävention, frühzeitige Erkennung und konsequente Behandlung sind daher von großer Bedeutung. Um das Verständnis für die Pathophysiologie zu fördern und ferner Therapieansätze ausfindig zu machen, ist es notwendig, nicht nur die Herzmuskelzellen im Blick zu haben, sondern auch die Komponenten des Herzmuskelstromas, die deren Funktion beeinflussen können. Das Verständnis und die Rekonstruktion des kardialen Gewebes auf ultrastruktureller Ebene, sowie die Charakterisierung und Wechselwirkungen der verschiedenen Zellen des Herzens haben deshalb das Interesse vieler Forschergruppen geweckt. Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte ultrastrukturelle Analyse kardialer Perizyten, Endothelzellen sowie Kapillarwand-assoziierter Zellen und deren Kontakte im Arbeitsmyokard der Maus mittels verschiedener elektronenmikroskopischer Methoden. Zu Beginn der Arbeit wurde die transmissionselektronenmikroskopische Probenaufbereitung optimiert und ein modifiziertes Protokoll zur hervorragenden Kontrastierung der biologischen Membranen und zum bestmöglichen Erhalt der Ultrastruktur etabliert. Die optimierte Probenaufbereitung bot dann die ideale Grundlage für die Generierung elektronenmikroskopischer Datensätze mittels serieller Block-Face Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) und anschließender Erzeugung dreidimensionaler Modelle der Mikrovaskulatur des Arbeitsmyokards der Maus. Die detaillierte ultrastrukturelle Analyse in drei Dimensionen offenbart neue morphologische Merkmale der kardialen Mikrovaskulatur und zeigt, dass die kardialen Perizyten vereinzelt Fortsätze abgeben, die mit den Endothelzellen assoziiert sind. Dadurch entsteht nicht nur eine perizytäre-endotheliale Einheit, die von derselben Basallamina umschlossen wird. Die Rekonstruktion zeigt ebenfalls, dass die Kapillarwand-assoziierten Zellen sehr groß und weit verzweigt sind und nicht von der die Perizyten und Endothelzellen umgebenden Basallamina umschlossen werden. Sie stehen an vereinzelten Stellen in direktem Kontakt mit den Endothelzellen. Immunelektronenmikroskopische Analysen zeigen, dass die Kapillarwand-assoziierten Zellen sowohl CD34-positiv als auch CD44-positiv sind. Größer angelegte Studien zur weiteren dreidimensionalen Analyse z.B. in der Intima einer Arteriole könnten zur weiteren Charakterisierung der Perizyten und der Kapillarwand-assoziierten Zellen beitragen und sogar eine Einteilung möglich machen. Eine Beteiligung von Perizyten im Rahmen des kardialen Remodeling nach einem Myokardinfarkt wurde bereits nachgewiesen. Außerdem spielen die Membranproteine CD34 und CD44 eine wichtige Rolle in der Hämatopoese und auch der Angiogenese. In Zukunft könnten sich auch daraus interessante neue Ansätze für gezielte Therapien nach einem Myokardinfarkt ergeben. / Cardiovascular diseases are prevalent, placing substantial stress both on affected individuals and on the healthcare system. The outcomes of cardiovascular diseases, including myocardial infarction and coronary heart disease, represent the leading cause of death globally. Consequently, emphasis on prevention, early identification, and sustained treatment is crucial. To enhance understanding of pathophysiology and pinpoint therapeutic strategies, it's imperative to concentrate not solely on the cardiac muscle cells, but also on the elements of the cardiac muscle stroma that can affect their function. The understanding and reconstruction of cardiac tissue at the ultrastructural level, as well as the characterization and interactions of the various cells of the heart have aroused the interest of many research groups. The primary goals of this paper were to conduct a detailed ultrastructural analysis of cardiac pericytes, endothelial cells, and cells associated with the capillary wall, as well as to examine their contacts in the working murine myocardium through various electron microscopic techniques. Initially, the sample preparation for transmission electron microscopy was optimized and a modified protocol to improve the contrast of biological membranes and ensure optimal preservation of the ultrastructure was set up. This refined sample preparation then served as the foundation for producing electron microscopic data sets with serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM). This facilitated the creation of three-dimensional models of the microvasculature in the murine working myocardium. Detailed ultrastructural analysis in three dimensions revealed new morphological features of the cardiac microvasculature and showed that the cardiac pericytes sporadically give off processes that are associated with the endothelial cells. This not only creates a pericytic-endothelial unit that is surrounded by the same basal lamina, but the reconstruction also showed that the capillary wall-associated cells are very large and widely branched and are not enclosed by the basal lamina surrounding the pericytes and endothelial cells. In isolated cases, they are in direct contact with the endothelial cells. Immunoelectron microscopic analyses reveal that the cells associated with the capillary wall are positive for both CD34 and CD44. Larger-scale studies for further three-dimensional analysis, e.g., in the intima of an arteriole, could contribute to the further characterization of the pericytes and the capillary wall-associated cells and even make a classification possible. The involvement of pericytes in cardiac remodeling after myocardial infarction has already been demonstrated. Moreover, the membrane proteins CD34 and CD44 hold significant importance in hematopoiesis and angiogenesis. In the future, this could pave the way for innovative approaches for targeted therapies following a myocardial infarction.

Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gezählte Leishmaniose wird durch intrazelluläre Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die länglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandmücke – der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im Säugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen näher untersucht, um demgemäß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zukünftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen könnten. Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellulärem Stress ihre Homöostase erhalten können. Durch diesen Prozess können überflüssige oder beschädigte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben übernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen. Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellulären Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erhöhte autophage Aktivität konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB bestätigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays führten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verknüpfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, nämlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erhöht sind. Durch siRNA-Analysen konnte überdies beobachtet werden, dass beide für die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind. Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte für mögliche zukünftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele für künftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungsärmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt näher. / Leishmaniasis, listed by the WHO to be one of the 17 most important NTDs, is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania. The life cycle of the parasites consists of two stages. The oblong and motile promastigotes characterize the stage in the sand fly, the vector of leishmaniasis. However, the stage in the vertebrate host is characterized by round immotile amastigotes. Due to a lack of capable antileishmanial therapies, the interaction between L. m. parasites and their main host cell, the macrophage, was investigated in the present work, huge focus on autophagic processes in infected macrophages. Our goal was to get new insights for the future production of antileishmanial drugs. Autophagy is a catabolic process whereby cells are able to maintain their homeostasis in times of starvation or cellular stress. During to this process, redundant or damaged organelles are recycled in order to sustain cellular viability. Furthermore, autophagy has an essential role in the defense of pathogens invading the cytosol. The newly established total autophagy score showed an autophagy induction in L. m.-infected BMDM. Intracellular amastigotes are digested by autophagy in BMDM. The increased autophagic activity could also be confirmed by western-blot analyses of the autophagy-relevant proteins ATG5, LC3B, and UB. Molecular genetic investigations of L. m.-infected BMDM by Affymetrix microarrays led to a network of autophagy-relevant and infection-specific genes, which was called LISA. Additionally, it showed a strong connection between autophagy-relevant genes and genes of the glycolysis, a second catabolic process. Moreover, we identified and further characterized two additional autophagy-relevant genes, Bnip3 and Ctse, which were not included in LISA. Both genes were significantly overexpressed on protein level in L. m.-infected BMDM. By siRNA analyses we also demonstrated their importance for successful elimination of amastigotes. Therefore, both proteins, BNIP3 and CTSE, could be new potential targets for possible future antileishmanial therapies. In addition, the genes included in LISA might be promising targets for future drugs against leishmaniasis. Due to all these investigations we are one step closer to our goal of a targeted and safe therapy of leishmaniasis.

Universiẗat, Diss.--Freiburg i. Br., 2000.