La connaissance du métabolisme demeure incomplète mais sa compréhension reste un but majeur tant pour la recherche fondamentale qu’appliquée. Environ 40% des gènes des organismes procaryotes n’ont pas de fonction précise proposée. En conséquence, de nombreuses voies métaboliques restent incomplètes, rendant très difficile la prédiction du métabolisme d’un organisme. Les recherches et les avancées dans la compréhension de la cascade des « omiques » incluant la génomique, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique jouent aujourd’hui un rôle central dans la connaissance du métabolisme. En tant qu’intermédiaires des réactions biochimiques, les métabolites connectent les différentes voies métaboliques d’un organisme. La quantité et la nature de ces molécules étant la résultante de l’expression des gènes, la composition en métabolites de la cellule est donc liée de très près à son phénotype. La métabolomique, qui étudie l’ensemble de ces petites molécules présentes dans un échantillon biologique, constitue une source d’informations importante nécessaire à la compréhension du métabolisme. En ce sens, le travail présenté dans ce manuscrit décrit la mise en place d’une approche métabolomique au sein du Genoscope pour l’étude du métabolisme de la bactérie modèle Acinetobacter baylyi (ADP1) en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution (LTQ-Orbitrap) couplée à la chromatographie liquide (LC/MS).Nous avons suivi la réorientation du métabolisme d’ADP1 à la suite d’une perturbation environnementale, induite par un changement de source de carbone. Nous avons comparé les métabolomes d’ADP1 cultivée sur succinate (source de carbone de référence) et sur quinate (source de carbone alternative). Environ 450 métabolites potentiels ont été détectés et plus d’une centaine ont pu être identifiés. Plusieurs phénomènes ont pu être observés. Premièrement, l’utilisation du quinate comme source de carbone engendre une réponse spécifique attendue, liée à sa dégradation (intermédiaires cataboliques détectés et gènes associés surexprimés). Toutefois, alors que le métabolisme central est peu affecté par ce changement biotique, la concentration d’environ la moitié des métabolites détectés est significativement modifiée. Ce résultat inattendu est en accord avec les expériences de transcriptomique qui indiquent, qu’avec ce changement de source de carbone, 12% des gènes sont différentiellement exprimés. Nos résultats montrent que la perturbation du métabolisme dans ces conditions s’étend bien au-delà de la voie de dégradation du quinate ; elle engendre un bouleversement global du métabolisme (Stuani, Lechaplais et al. 2014).Cette étude a également permis de détecter de nouveaux métabolites, produits dans des cellules utilisant du quinate. L’élucidation structurale de l’un d’entre eux est décrite dans ce manuscrit. Il s’agit d’une tyrosine substituée en position benzylique par un groupement méthylamine (BMAT). Son identification aura nécessité des expériences de CID-MSn séquentielles avec détection à haute résolution et d’échanges H/D. Des études structurales effectuées sur deux autres molécules suggèrent des similarités structurales entre elles et avec le BMAT. Nous pourrions donc être en présence d’une famille de nouveaux métabolites secondaires, impliqués dans une même voie métabolique. C’est donc une approche métabolomique qui a permis à un simple changement de source de carbone de nous orienter vers la découverte de nouvelles voies métaboliques et d’appréhender une part cachée du métabolisme d’ADP1. / While incomplete, the knowledge of metabolism remains a priority for both basic and applied research. With approximately 40 % of genes of prokaryotic genomes with no accurate function, a number of metabolic pathways remain incomplete, which impedes the accurate prediction of the metabolism of a cell.Recent progress and breakthroughs in the understanding of the Omics Cascade that includes genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics play an important role in the knowledge of metabolism. As intermediaries of biochemical reactions, metabolites connect the different metabolic pathways of the cell. The amount and nature of these molecules being the result of gene expression, the metabolite content of a cell is thus closely related to its phenotype. Metabolomics, which aims at studying the whole set of metabolites present in a biological sample, is an invaluable source of information for the understanding of metabolism.This is why the work presented in this thesis reports the setup of a metabolomic approach at Genoscope for the study of metabolism of the model bacterium Acinetobacter baylyi ADP1 (ADP1) through high-resolution mass spectrometry (LTQ-Orbitrap) coupled to liquid chromatography (LC/MS).We investigated the metabolism of ADP1 after an environmental perturbation induced by a change of carbon source. We compared the metabolomes of ADP1 grown on succinate (reference carbon source) and on quinate (alternative source). About 450 potential metabolites could be detected and more than a hundred were identified. Many observations were made. First, quinate as a carbon source triggered an expected specific metabolic response in relation with its dissimilation (quinate catabolites were detected and the corresponding genes were up-regulated). However, while central metabolism is not impacted by this biotic change, about half of the detected metabolites had their concentration changed. This unexpected result is consistent with transcriptomic experiments that revealed that with the change of carbon source, 12% of the total number of genes are differentially expressed. Our results show that in these conditions, metabolic alteration goes far beyond the quinate degradation pathway and causes a global overhaul of the metabolism of ADP1 (Stuani, Lechaplais et al. 2014).This study also led to the detection of novel metabolites that were exclusively produced in quinate-grown cells. The structural elucidation of one of them is reported in this manuscript. It is a tyrosine substituted in the benzylic position by an aminomethyl group (BMAT). Its identification required sequential CID-MSn experiments with high-resolution detection and isotopic H/D exchange experiments. Structural studies conducted on two other molecules suggest structural similarities with BMAT. We thus could be in the presence of a family of novel secondary metabolites, involved in the same metabolic pathway.In conclusion, a metabolomic approach allowed a mere change of carbon source to guide us toward the discovery of novel metabolic pathways and gain insight into the hidden part of ADP1 metabolism.