Gossypium barbadense L. “algodón nativo” es oriundo de la costa norte del Perú y se caracteriza por presentar fibras de colores naturales. La evaluación del efecto de diferentes concentraciones de fitorreguladores de crecimiento en la inducción de callo embriogénico se realizó en explantes de hipocotilo de G. barbadense L. “algodón nativo” color pardo, bajo dos condiciones lumínicas distintas. La desinfección de semillas se llevó a cabo utilizando NaOCl al 2.5% en distintos tiempos de exposición (5-20 min) para obtener plántulas in vitro. Para la iniciación y proliferación de callos, se introdujeron explantes de hipocotilo (con 5 réplicas) en medios Murashige-Skoog (MS) suplementados con diferentes concentraciones de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), kinetina (Kin) y agua de coco. Los callos friables de mayor proliferación fueron transferidos a medios MS con distintas concentraciones de Kin, 2,4-D y ácido indol-3-butírico (IBA) para la inducción de callo embriogénico. Los cultivos fueron mantenidos en condiciones de fotoperiodo 16 h luz/ 8 h oscuridad y oscuridad continua. Se logró el 100% de desinfección de semillas en 10 min de exposición al desinfectante. En 85% a 100% de explantes de hipocotilo se obtuvo la formación de callo en todos los tratamientos de iniciación de callo incubados en ambas condiciones lumínicas durante 21 días. La mayor proliferación de callo friable se obtuvo en 82.5% de explantes cultivados en medio MS enriquecido con 0.1 mg/l de 2,4-D y 100 ml/l de agua de coco e incubados en fotoperiodo 16 h luz/ 8 h oscuridad. En los medios MS suplementados con distintas concentraciones de Kin, 2,4-D e IBA no se logró la inducción de callo embriogénico. Sin embargo, en el medio MS sin reguladores de crecimiento y en el suplementado con 0.05 mg/l de Kin y 0.3 mg/l de IBA, en fotoperiodo 16 h luz/ 8 h oscuridad, se inició la organogénesis radical.Gossypium barbadense L. “native cotton” is originally from the northern coast of Peru and is characterized by its naturally colored fibers. The evaluation of the effect of different concentrations of plant growth regulators on embryogenic callus induction was performed in hypocotyl explants of Gossypium barbadense L. “native cotton” brown, under two different lighting conditions. Seed disinfection was carried out using 2.5% NaOCl in different exposure times (5-20 min) in order to obtain in vitro plants. For initiation and proliferation of callus, hypocotyl explants (with 5 replicates) were placed in Murashige-Skoog (MS) medium supplemented with different concentrations of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), kinetin (Kin) and coconut water. Friable calli with the highest proliferation were transferred to MS medium with different concentrations of Kin, 2,4-D and indole-3-butyric acid (IBA) for induction of embryogenic callus. The cultures were maintained under conditions of 16 h light/ 8 h dark photoperiod and continuous darkness. 100% of seed disinfection was achieved at 10 min of exposure to disinfectant. In 85% to 100% of hypocotyl explants, callus formation was obtained in all callus induction treatments, incubated in both lighting conditions during 21 days. The highest proliferation of friable callus was obtained in 82.5% of hypocotyl explants cultivated in MS medium enriched with 0.1 mg/l 2,4-D and 100 ml/l coconut water, in 16 h light/ 8 h dark photoperiod. In MS medium supplemented with different concentrations of Kin, 2,4-D and IBA, induction of embryogenic callus was not achieved. However, in MS medium without growth regulators and supplemented with 0.05 mg/l Kin and 0.3 mg/l IBA, in 16 h light/ 8 h dark photoperiod, root organogenesis was initiated.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-07T17:17:10Z No. of bitstreams: 1 Deivid Almeida da Costa.pdf: 3034904 bytes, checksum: a3834e78a3b01627180c99a9fddc24a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T17:17:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Deivid Almeida da Costa.pdf: 3034904 bytes, checksum: a3834e78a3b01627180c99a9fddc24a9 (MD5) Previous issue date: 2007-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The somatic embryogenesis is a technique of plant tissue culture with several application potentials, as in the clonal propagation of plants, in the regeneration of transformed cells and in the basic studies of the molecular, biochemical and morphologic events that happen duringthe embryogenesis. In spite of the several works reporting somatic embryogenesis in cotton, several problems still persist in the regeneration through embryogenesis. The most of the works is with the line cocker, due to the fact of the cotton to be recalcitrant for the somatic embryogenesis. This way, the present study was conceived with the intention of analyzing the morphogenic response of the cotton to several growth regulators and stressful agents during the induction of embryogenic callus and somatic embryos, correlating the callus production with the antioxidant enzymes expression. For induction of the embryogenic callus, hypocotyl of germinated cotton (BRS – 187 – 8H) surface-sterilized seeds was used. The embriogenic callus induction medium (MICE) consisted of the MSB medium with different combinations and concentrations of 2,4-D, Kinetin, 2iP and Picloram. For conversion of embryogenic callus, it was used the embryo induction medium (MIE) that consistes of MSB medium and MSB supplemented with zeatin; L-glutamine, asparagine; espermine, espermidine or different concentrations of NH4NO3 and KNO3. The results show that among the MICE tested, the medium with 0,1 mg L-1 2,4-D and 0,3 mg L-1 Kinetin (MSB1 medium) and the MCIM medium showed the largest average in the production of embryogenic callus by explant. Explants in the MIE-1 presented the best proliferation of the embryogenic callus. However, the formation of globular and embryogenic structures was only visualized in the embryogenic callus formed in MSB1 medium, which were transferred for MSB medium and subcultivated in MIE-4 medium. It was concluded that different growth regulators can induce the formation of embryogenic callus in cotton cultivar BRS – 187 – 8H and the suppression of the growth regulators favors the appearance of globular and pre-embryogenic structures. In the experiments of the influence of the stress in cotton callus formation and the isozymic antioxidant system expression, it was used for induction of embryogenic callus, thecombination of MSB and MSB1 medium with two concentrations of FeEDTA: the concentration standard of the MS medium; and a concentration five times larger. It wasestablished three regimes of luminous intensity: darkness; 3,4 Klx and 6,0 Klx. Embryogenic callus were obtained on the MSB1 (3,4 Klx), MSB1 (6,0 Klx) and MSB1+FeEDTA (5X) medium. The electrophoretic system of the catalase and peroxidase showed variation in the intensity of the bands. The results show that the embryogenic callus formation dependent of the action of growth regulators and of the light presence, and the isozymic standards of catalase and peroxidase present similar pattern and they are related with the embryogenic aspect of the calluses. / A embriogênese somática é uma técnica de cultura de tecidos vegetais com diversos potenciais de aplicação, como na propagação clonal de plantas, na regeneração de células transformadas geneticamente e nos estudos básicos dos eventos moleculares e bioquímicos e morfológicos que ocorrem durante a embriogênese. Apesar dos diversos trabalhos relatando embriogênese somática em algodão, vários problemas ainda persistem na regeneração via embriogênese e a maioria dos trabalhos é com a linha cocker, devido a recalcitrância do algodão a embriogênese somática. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de analisar a resposta morfogênica do algodão a vários reguladores de crescimento e agentes estressantes durante a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos, correlacionando a calogênese com a expressão de isoformas do sistema antioxidativo. Para indução dos calos embriogênicos utilizou-se sementes desinfestadas da cultivar de algodão BRS – 187 – 8H. Os meios de indução de calos embriogênicos (MICE) utilizados consistiram no meio MSB acrescido de varias combinações e concentrações dos reguladores de crescimento 2,4-D; Cinetina, Picloram e 2-iP. Já para conversão dos calos embriogênicos em embriões, utilizouse o meio de indução de embiões (MIE) que consiste no meio MSB e MSB acrescido dezeatina, ou diferentes concentrações de NH4NO3 e KNO3, ou acrescido de L glutamina; asparagina; espermina; espermidina. Os dados obtidos mostram que entre os MICE testados, o meio contendo 0,1 mg L-1 de 2,4-D e 0,3 mg L-1 de cinetina (meio MSB1) e o meio MCIM mostraram as maiores médias na produção de calos embriogênicos por explante. Entre os MIE, o MIE-1 apresentou melhor proliferação dos calos embriogênicos. Contudo, a formação de estruturas globulares e embriogênicas só foi visualizada nos calos embriogênicos formados em meio MSB1 e transferidos para meio MSB e subcultivados em meio MIE-4. Concluiu-se então que diferentes reguladores podem induzir a formação de calos embriogênicos na cultivar BRS – 187 – 8H, e a supressão dos reguladores de crescimento favorece o surgimento de estruturas globulares e pré-embriogênicas. Nos experimentos da influência do estresse na calogênese e a expressão de isoenzimas do sistema antioxidativo, utilizou-se para a induçãode calos embriogênicos a combinação do meio MSB e MSB1 com duas concentrações de FeEDTA: a concentração padrão do meio MS; e uma concentração cinco vezes maior. E foiestabelecido três regimes de intensidade luminosa: escuro; 3,4 Klx e 6,0 Klx. Calos embriogênicos foram obtidos nos meios MSB1(3,4 Klx), MSB1(6,0 Klx) e MSB1+FeEDTA(5X). Analises de eletroforese de isoenzimas da catalase e peroxidase mostraram variação na intensidade das bandas. Os resultados obtidos permitiram concluir que formação de calos embriogênicos é dependente da ação de reguladores de crescimento e da presença de luz, e que as isoformas de catalase e peroxidase apresentam padrão similar e estão relacionadas com o aspecto embriogênico dos calos.

The embryogenic calli were grown on MS medium containing NaCl with concentrations from 50 to 300 mM. After 2 weeks of culture, salinity tolerance threshold was identified at 150 mM NaCl. Higher concentrations of NaCl stimulated a significant reduction in the calli survival rate and the highest rate was 78.67% at 50 mM. After subculturing callus to the embryo culture medium containing NaCl, the growth and embryogenesis were not affected at the concentrations of 50 – 100 mM. Especially, at 50 mM NaCl the embryogenesis rate reached 83.33%. In contrast, 150 mM NaCl inhibited the somatic embryogenesis. After 4 weeks, culturing somatic embryos on medium MS with addition of 0.07 mg/l spermidin at 50 – 100 mM NaCl, the embryogenesis was considered good and embryos developed through several stages: globular, heart, torpedo and cotyledonary. However, at 150 mM NaCl the globular stage appeared in the culture process. The process of morphohistology and using dye carmine – iod and acridine orange observed the structure of generative callus and embryos at several stages. / Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được nuôi cấy trong môi trường có chứa muối NaCl với nồng độ thay đổi từ 50 – 300 mM. Sau 2 tuần nuôi cấy, chúng tôi xác định được ngưỡng chịu mặn của mô sẹo có khả năng sinh phôi cây Cọc rào là 150 mM. Nồng độ muối NaCl càng cao thì tỷ lệ sống của mô sẹo giảm dần và đạt giá trị cao nhất là 78,67% tại nồng độ 50 mM NaCl. Khi chuyển mô sẹo sang môi trường phát sinh phôi có chứa muối NaCl với nồng độ thay đổi, chúng tôi thấy ở nồng độ muối NaCl 50 – 100 mM không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát sinh phôi, đặc biệt là tại nồng độ 50 mM NaCl giúp kích thích sự hình thành phôi từ mô sẹo với tỷ lệ hình thành phôi đạt 83,33%. Ngược lại, nồng độ từ 150 mM NaCl gây ức chế quá trình hình thành phôi soma từ mô sẹo. Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của muối đến khả năng phát triển và nảy mầm của phôi soma. Ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy phôi soma trong môi trường MS có bổ sung 0.07 mg/l spermidin, tại nồng độ 50 – 100 mM NaCl khả năng hình thành phôi tốt và phôi phát triển qua các giai đoạn phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm. Đặc biệt ở nồng độ 50 mM số lượng phôi lá mầm đạt giá trị cao với 13,33 phôi. Nồng độ muối NaCl 150 mM chỉ xuất hiện phôi hình cầu trong suốt thời gian nuôi cấy. Quá trình giải phẫu hình thái phôi và sử dụng thuốc nhuộm 2 màu carmin – iod và acridine orange đã cho thấy rõ hơn về cấu trúc mô sẹo có khả năng sinh phôi và phôi hình thái.

The embryogenic calli were grown on MS medium containing NaCl with concentrations from 50 to 300 mM. After 2 weeks of culture, salinity tolerance threshold was identified at 150 mM NaCl. Higher concentrations of NaCl stimulated a significant reduction in the calli survival rate and the highest rate was 78.67% at 50 mM. After subculturing callus to the embryo culture medium containing NaCl, the growth and embryogenesis were not affected at the concentrations of 50 – 100 mM. Especially, at 50 mM NaCl the embryogenesis rate reached 83.33%. In contrast, 150 mM NaCl inhibited the somatic embryogenesis. After 4 weeks, culturing somatic embryos on medium MS with addition of 0.07 mg/l spermidin at 50 – 100 mM NaCl, the embryogenesis was considered good and embryos developed through several stages: globular, heart, torpedo and cotyledonary. However, at 150 mM NaCl the globular stage appeared in the culture process. The process of morphohistology and using dye carmine – iod and acridine orange observed the structure of generative callus and embryos at several stages. / Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được nuôi cấy trong môi trường có chứa muối NaCl với nồng độ thay đổi từ 50 – 300 mM. Sau 2 tuần nuôi cấy, chúng tôi xác định được ngưỡng chịu mặn của mô sẹo có khả năng sinh phôi cây Cọc rào là 150 mM. Nồng độ muối NaCl càng cao thì tỷ lệ sống của mô sẹo giảm dần và đạt giá trị cao nhất là 78,67% tại nồng độ 50 mM NaCl. Khi chuyển mô sẹo sang môi trường phát sinh phôi có chứa muối NaCl với nồng độ thay đổi, chúng tôi thấy ở nồng độ muối NaCl 50 – 100 mM không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát sinh phôi, đặc biệt là tại nồng độ 50 mM NaCl giúp kích thích sự hình thành phôi từ mô sẹo với tỷ lệ hình thành phôi đạt 83,33%. Ngược lại, nồng độ từ 150 mM NaCl gây ức chế quá trình hình thành phôi soma từ mô sẹo. Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của muối đến khả năng phát triển và nảy mầm của phôi soma. Ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy phôi soma trong môi trường MS có bổ sung 0.07 mg/l spermidin, tại nồng độ 50 – 100 mM NaCl khả năng hình thành phôi tốt và phôi phát triển qua các giai đoạn phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và hình lá mầm. Đặc biệt ở nồng độ 50 mM số lượng phôi lá mầm đạt giá trị cao với 13,33 phôi. Nồng độ muối NaCl 150 mM chỉ xuất hiện phôi hình cầu trong suốt thời gian nuôi cấy. Quá trình giải phẫu hình thái phôi và sử dụng thuốc nhuộm 2 màu carmin – iod và acridine orange đã cho thấy rõ hơn về cấu trúc mô sẹo có khả năng sinh phôi và phôi hình thái.