Endostatina, um fragmento do colágeno XVIII de 20 kDa, é um potente inibidor de angiogênese e crescimento tumoral. Foi previamente demonstrado que a administração contínua de endostatina em modelos animais melhorou a eficácia e potência da terapia antitumoral, comparada com a administração subcutânea diária por injeções de endostatina. A liberação contínua da proteína antiangiogênica endostatina para a circulação sistêmica poderia ser um tratamento antiangiogênico ideal. O sistema Theracyte é um sistema de membranas de politetrafluoretileno semi-permeáveis para macro-encapsulamento e implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo e que não requer a imunossupressão do hospedeiro. Com a finalidade de demonstrar a utilidade deste sistema, células CHO expressando (his)6-met-endostatina foram injetadas em dispositivos de imunoisolamento Theracyte, que foram imediatamente implantados em camundongos imunodeficientes (SCID). Em outro modelo de implante de dispositivos de imunoisolamento, os dispositivos Theracyte foram implantados em animais e depois do tempo de cicatrização (17 dias), as células expressando endostatina foram injetadas dentro dos dispositivos. Níveis altos e constantes de endostatina de até 3,7 g/ml foram detectados no plasma durante os dois meses de duração do estudo em ambos os modelos de implante dos dispositivos de imunoisolamento. Níveis mais altos de endostatina (até 6,7 g/ml) foram detectados no plasma de animais implantados com o mesmo número de células livres. Análise histológica de cortes corados por hematoxilina/eosina dos dispositivos retirados dos animais mostraram que haviam células aparentemente viáveis dentro dos dispositivos. A análise imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina mostrou a existência de reação nas células dentro do dispositivo e também do lado de fora, demonstrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas, extravasou da membrana, atingindo os tecidos ao redor. / Endostatin, a 20 kDa C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent inhibitor of angiogenesis and tumor growth. It has been shown that endostatin continuous administration in animal models improves the efficacy and potency of the antitumoral therapy, compared to bolus subcutaneous daily administration. Continuous delivery of the antiangiogenic protein endostatin to the systemic circulation would be an optimal treatment for tumor. The Theracyte system is a semi-permeable membrane macro-encapsulation system for implantation of genetically engineered cells for therapeutic proteins delivery in vivo and which do not require host immunosuppression. To demonstrate the utility of this system, CHO cells expressing (his)6- met-endostatin where loaded into Theracyte immunoisolation devices which were immediately implanted into SCID mice. In another model for the immunoisolation devices implant, Theracyte devices were implanted into animals and after healing (17 days later), the cells expressing endostatin were injected within the devices. High and constant levels of endostatin of up to 3,7 g/ml were detected in plasma throughout the two months duration of the study in both models of immunoisolation device implant. Higher plasma levels of endostatin (up to 6,7 g/mL) were observed in animals implanted with the same amount of free cells. Histological analysis of hematoxilin/eosin stained devices withdrawn from the animals showed that there were apparently viable cells within the devices. Immunohistochemistry using anti-endostatin antibody showed that there are reaction in the cells within the devices and outside them, demonstrating that endostatin, secreted by the confined recombinant cells, permeated trough the membrane, reaching the surrounding tissues.

Endostatina, um fragmento do colágeno XVIII de 20 kDa, é um potente inibidor de angiogênese e crescimento tumoral. Foi previamente demonstrado que a administração contínua de endostatina em modelos animais melhorou a eficácia e potência da terapia antitumoral, comparada com a administração subcutânea diária por injeções de endostatina. A liberação contínua da proteína antiangiogênica endostatina para a circulação sistêmica poderia ser um tratamento antiangiogênico ideal. O sistema Theracyte é um sistema de membranas de politetrafluoretileno semi-permeáveis para macro-encapsulamento e implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo e que não requer a imunossupressão do hospedeiro. Com a finalidade de demonstrar a utilidade deste sistema, células CHO expressando (his)6-met-endostatina foram injetadas em dispositivos de imunoisolamento Theracyte, que foram imediatamente implantados em camundongos imunodeficientes (SCID). Em outro modelo de implante de dispositivos de imunoisolamento, os dispositivos Theracyte foram implantados em animais e depois do tempo de cicatrização (17 dias), as células expressando endostatina foram injetadas dentro dos dispositivos. Níveis altos e constantes de endostatina de até 3,7 g/ml foram detectados no plasma durante os dois meses de duração do estudo em ambos os modelos de implante dos dispositivos de imunoisolamento. Níveis mais altos de endostatina (até 6,7 g/ml) foram detectados no plasma de animais implantados com o mesmo número de células livres. Análise histológica de cortes corados por hematoxilina/eosina dos dispositivos retirados dos animais mostraram que haviam células aparentemente viáveis dentro dos dispositivos. A análise imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina mostrou a existência de reação nas células dentro do dispositivo e também do lado de fora, demonstrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas, extravasou da membrana, atingindo os tecidos ao redor. / Endostatin, a 20 kDa C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent inhibitor of angiogenesis and tumor growth. It has been shown that endostatin continuous administration in animal models improves the efficacy and potency of the antitumoral therapy, compared to bolus subcutaneous daily administration. Continuous delivery of the antiangiogenic protein endostatin to the systemic circulation would be an optimal treatment for tumor. The Theracyte system is a semi-permeable membrane macro-encapsulation system for implantation of genetically engineered cells for therapeutic proteins delivery in vivo and which do not require host immunosuppression. To demonstrate the utility of this system, CHO cells expressing (his)6- met-endostatin where loaded into Theracyte immunoisolation devices which were immediately implanted into SCID mice. In another model for the immunoisolation devices implant, Theracyte devices were implanted into animals and after healing (17 days later), the cells expressing endostatin were injected within the devices. High and constant levels of endostatin of up to 3,7 g/ml were detected in plasma throughout the two months duration of the study in both models of immunoisolation device implant. Higher plasma levels of endostatin (up to 6,7 g/mL) were observed in animals implanted with the same amount of free cells. Histological analysis of hematoxilin/eosin stained devices withdrawn from the animals showed that there were apparently viable cells within the devices. Immunohistochemistry using anti-endostatin antibody showed that there are reaction in the cells within the devices and outside them, demonstrating that endostatin, secreted by the confined recombinant cells, permeated trough the membrane, reaching the surrounding tissues.

Endostatina é um inibidor específico de proliferação de células endoteliais, migração e um potente inibidor de angiogênese. Foi demonstrado que a administração contínua de endostatina é mais efetiva na supressão tumoral do que a mesma dose administrada s.c. diariamente. Encontrar a concentração de endostatina para combater o crescimento tumoral é complicado pela pequena meia vida da proteína. O transplante de células encapsuladas em dispositivos de imunoisolamento é uma abordagem promissora para muitas doenças, pois permite uma liberação por longo tempo da proteína com propriedades terapêuticas. A membrana semipermeável pode proteger as células da rejeição do sistema imune, para evitar o problema de toxicidade, meia vida limitada e variação nos níveis circulantes. O dispositivo Theracyte® é um sistema de membranas semipermeáveis para macroencapsulamento que permite o implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo sem a necessidade de imunosupressão do hospedeiro. Foi demonstrado neste estudo que fibroblastos murinos (células LM) expressando 0,4 µg de endostatina murina/106 células em 24 horas se apresentam como uma abordagem promissora para terapia tumoral. O sistema de liberação é composto de células LM produtoras de endostatina encapsuladas em macrocápsulas Theracyte para imunoisolamento de células. Para demonstrar a utilidade deste sistema, modelos de camundongos com tumores de Ehrlich e melanoma foram tratados com 107 células encapsuladas expressando endostatina. Foram analisados dois protocolos para o implante dos dispositivos: No primeiro, os dispositivos foram implantados nos animais e após 14 dias (cicatrização das feridas), as células expressando endostatina foram implantadas no interior destes dispositivos. Em um segundo, os dispositivos contendo as células foram implantados nos animais. O crescimento do tumor melanoma foi reduzido de 42% pela utilização do primeiro protocolo de implante e de 54% quando o segundo protocolo foi utilizado. O crescimento do tumor de Ehrlich foi reduzido de 25% utilizando o primeiro protocolo de implante. A imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina demonstrou a liberação da endostatina para o estroma ao redor do dispositivo, mostrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas permeou através da membrana, atingindo os tecidos adjacentes. A efetividade da ação da endostatina na neovascularização de melanoma (B16-F10) foi determinada pela análise do número de estruturas vasculares, analisadas por imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-CD34. Foi demonstrado um decréscimo de 41,5% no número de estruturas vasculares, 35,9% no número de vasos viáveis e de 33,5% na extensão da área vascular no grupo tratado. Os resultados descritos são promissores e podem oferecer uma alternativa para uma variedade te tipos de tumores. / Endostatin is a specific inhibitor of endothelial cell proliferation, migration and a potent angiogenesis inhibitor. It has been shown that continuous administration of endostatin is more effective in tumor suppression than the same dose administered s.c. daily. Achieving concentration of endostatin to combat tumor growth is complicated by the short life of the protein. Transplantation of encapsulated cells in immunoisolation devices is a promising approach for many diseases since it allows a long-term delivery of the therapeutic protein and the semi-permeable membrane can protect cell from host’s immune rejection, to circumvent the problem of toxicity, limited half life and variation in circulating levels. The Theracyte® device is a semi-permeable membrane macroencapsulation system for implantation of genetically engineered cells for therapeutic proteins delivery in vivo and which does not require host immunosuppression. It was shown in this study that encapsulated recombinant murine fibroblasts (LM) expressing 0.4µg of murine endostatina/106 cells in 24 hours presents a feasible approach to tumor therapy. The delivery system was composed of recombinant endostatin-producing LM murine cells encapsulated into Theracyte macrocapsule for immunoisolation of cells. To demonstrate the usefulness of this system, experimental mice models with Ehrlich and Melanoma tumors were treated with 107 encapsulated endostatin-expressing cells. Two protocols were used for the implant of the devices: 1) The devices were implanted in the animals and after 14 days (wound healing), the cells expressing endostatin were implanted into the device and 2) the devices were implanted in the animals containing the cells. Melanoma tumor growth was reduced by 42% using the first implant protocol and by 54% when the second protocol was used. Ehrlich tumor growth was reduced by 25% using the first device implant protocol. As revealed by anti-endostatin immunostaining, there was a release of endostatin to the tissue outside the devices, demonstrating that endostatin, secreted by the confined recombinant cells, permeated trough the membrane, reaching the surrounding tissues. The effectiveness of endostatin delivery on the neovascularization of melanoma (B16-F10) was determined by analysis of the number of vascular structures, accessed by immunohistochemistry using anti-CD-34 antibody. It was shown that there was a decrease of 41.5% in the number of vascular structures, 35.9% in the number of viable vessels and 33.5% in the extension of vascular area in the treated group. The results described are quite promising and may offer an alternative for the treatment of a variety of tumor types. LISTA

Endostatina é um inibidor específico de proliferação de células endoteliais, migração e um potente inibidor de angiogênese. Foi demonstrado que a administração contínua de endostatina é mais efetiva na supressão tumoral do que a mesma dose administrada s.c. diariamente. Encontrar a concentração de endostatina para combater o crescimento tumoral é complicado pela pequena meia vida da proteína. O transplante de células encapsuladas em dispositivos de imunoisolamento é uma abordagem promissora para muitas doenças, pois permite uma liberação por longo tempo da proteína com propriedades terapêuticas. A membrana semipermeável pode proteger as células da rejeição do sistema imune, para evitar o problema de toxicidade, meia vida limitada e variação nos níveis circulantes. O dispositivo Theracyte® é um sistema de membranas semipermeáveis para macroencapsulamento que permite o implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo sem a necessidade de imunosupressão do hospedeiro. Foi demonstrado neste estudo que fibroblastos murinos (células LM) expressando 0,4 µg de endostatina murina/106 células em 24 horas se apresentam como uma abordagem promissora para terapia tumoral. O sistema de liberação é composto de células LM produtoras de endostatina encapsuladas em macrocápsulas Theracyte para imunoisolamento de células. Para demonstrar a utilidade deste sistema, modelos de camundongos com tumores de Ehrlich e melanoma foram tratados com 107 células encapsuladas expressando endostatina. Foram analisados dois protocolos para o implante dos dispositivos: No primeiro, os dispositivos foram implantados nos animais e após 14 dias (cicatrização das feridas), as células expressando endostatina foram implantadas no interior destes dispositivos. Em um segundo, os dispositivos contendo as células foram implantados nos animais. O crescimento do tumor melanoma foi reduzido de 42% pela utilização do primeiro protocolo de implante e de 54% quando o segundo protocolo foi utilizado. O crescimento do tumor de Ehrlich foi reduzido de 25% utilizando o primeiro protocolo de implante. A imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina demonstrou a liberação da endostatina para o estroma ao redor do dispositivo, mostrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas permeou através da membrana, atingindo os tecidos adjacentes. A efetividade da ação da endostatina na neovascularização de melanoma (B16-F10) foi determinada pela análise do número de estruturas vasculares, analisadas por imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-CD34. Foi demonstrado um decréscimo de 41,5% no número de estruturas vasculares, 35,9% no número de vasos viáveis e de 33,5% na extensão da área vascular no grupo tratado. Os resultados descritos são promissores e podem oferecer uma alternativa para uma variedade te tipos de tumores. / Endostatin is a specific inhibitor of endothelial cell proliferation, migration and a potent angiogenesis inhibitor. It has been shown that continuous administration of endostatin is more effective in tumor suppression than the same dose administered s.c. daily. Achieving concentration of endostatin to combat tumor growth is complicated by the short life of the protein. Transplantation of encapsulated cells in immunoisolation devices is a promising approach for many diseases since it allows a long-term delivery of the therapeutic protein and the semi-permeable membrane can protect cell from host’s immune rejection, to circumvent the problem of toxicity, limited half life and variation in circulating levels. The Theracyte® device is a semi-permeable membrane macroencapsulation system for implantation of genetically engineered cells for therapeutic proteins delivery in vivo and which does not require host immunosuppression. It was shown in this study that encapsulated recombinant murine fibroblasts (LM) expressing 0.4µg of murine endostatina/106 cells in 24 hours presents a feasible approach to tumor therapy. The delivery system was composed of recombinant endostatin-producing LM murine cells encapsulated into Theracyte macrocapsule for immunoisolation of cells. To demonstrate the usefulness of this system, experimental mice models with Ehrlich and Melanoma tumors were treated with 107 encapsulated endostatin-expressing cells. Two protocols were used for the implant of the devices: 1) The devices were implanted in the animals and after 14 days (wound healing), the cells expressing endostatin were implanted into the device and 2) the devices were implanted in the animals containing the cells. Melanoma tumor growth was reduced by 42% using the first implant protocol and by 54% when the second protocol was used. Ehrlich tumor growth was reduced by 25% using the first device implant protocol. As revealed by anti-endostatin immunostaining, there was a release of endostatin to the tissue outside the devices, demonstrating that endostatin, secreted by the confined recombinant cells, permeated trough the membrane, reaching the surrounding tissues. The effectiveness of endostatin delivery on the neovascularization of melanoma (B16-F10) was determined by analysis of the number of vascular structures, accessed by immunohistochemistry using anti-CD-34 antibody. It was shown that there was a decrease of 41.5% in the number of vascular structures, 35.9% in the number of viable vessels and 33.5% in the extension of vascular area in the treated group. The results described are quite promising and may offer an alternative for the treatment of a variety of tumor types. LISTA

A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada. Vetores bicistrônicos são uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. Na construção de um vetor bicistrônico pode-se empregar várias estratégias dentre elas a utilização da sequência IRES. A endostatina, fragmento do colágeno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiogênica devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequência IRES. A construção do vetor foi realizada em três etapas, sendo comprovada a construção final por análise de restrição e seqüenciamento. Células de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdução na célula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de análise da expressão por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor construído apresentou altos níveis de titulação viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determinação da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89μg/106cels.24h, respectivamente. A expressão da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior á apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibição da proliferação de 40% das células endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma proliferação de 10.6% de linfócitos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a construção obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do câncer e novas estratégias terapêuticas. / Gene therapy has been used in preclinical studies and clinical trials in order to alleviate or cure a disease. Retroviral vectors are a tool for gene transfer is widely used. Bicistronic vectors are an attractive alternative for treatment of complex diseases. A variety of options exists to simultaneously express two genes in genetically modified cells. The most common approach relies on bicistronic vectors in which the genes are linked to each other by an internal ribosome entry site allowing co-translational expression of both cistrons. Endostatin, the C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent angiogenesis inhibitor. At present, ES has been widely used in anti-angiogenic in a variety of experimental tumor models, and clinical trials to test it as an anti-tumor agent are already under way. Immunotherapy has been used as adjuvant treatment for tumors and has been used in several preclinical studies and clinical trials. The objective of this project was to construct and characterize in vitro an IRES-based bicistronic retroviral vector encoding endostatin and intereukin-2. The construction of the vector was performed in three stages, the final construction was analyzed by restriction analysis and sequencing. Packaging cells were prepared. The endostatin and interleukin-2 levels were determined by Dot blot. Monocistronic and bicistronic mRNA expression were analyzed by real time RT-PCR. Bicistronic vector showed high levels of virus trites, ranging from 4.20x105 to 1.53x106UFC/mL. Secreted levels of endostatin and interleukin-2 ranged from 1.08 to 2.08μg/106cells.24h and 0.66 - 0.89g/106cells.24h, respectively. The mRNA expression of ES in the NIH3T3 clone pLend-IRES-IL2SN was 2 times higher than the level presented by the NIH3T3 clone pLendSN. The endostatin promoted inhibition (40%) of endothelial cell proliferation. Interleukin-2 promoted a proliferation of 10.6% lymphocytes CD4 and 8.9% of CD8. We conclude that the IRES bicistronic vector provides a powerful tool for studies of cell biology of cancer and new therapeutic strategies.

A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada. Vetores bicistrônicos são uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. Na construção de um vetor bicistrônico pode-se empregar várias estratégias dentre elas a utilização da sequência IRES. A endostatina, fragmento do colágeno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiogênica devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequência IRES. A construção do vetor foi realizada em três etapas, sendo comprovada a construção final por análise de restrição e seqüenciamento. Células de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdução na célula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de análise da expressão por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor construído apresentou altos níveis de titulação viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determinação da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89μg/106cels.24h, respectivamente. A expressão da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior á apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibição da proliferação de 40% das células endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma proliferação de 10.6% de linfócitos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a construção obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do câncer e novas estratégias terapêuticas. / Gene therapy has been used in preclinical studies and clinical trials in order to alleviate or cure a disease. Retroviral vectors are a tool for gene transfer is widely used. Bicistronic vectors are an attractive alternative for treatment of complex diseases. A variety of options exists to simultaneously express two genes in genetically modified cells. The most common approach relies on bicistronic vectors in which the genes are linked to each other by an internal ribosome entry site allowing co-translational expression of both cistrons. Endostatin, the C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent angiogenesis inhibitor. At present, ES has been widely used in anti-angiogenic in a variety of experimental tumor models, and clinical trials to test it as an anti-tumor agent are already under way. Immunotherapy has been used as adjuvant treatment for tumors and has been used in several preclinical studies and clinical trials. The objective of this project was to construct and characterize in vitro an IRES-based bicistronic retroviral vector encoding endostatin and intereukin-2. The construction of the vector was performed in three stages, the final construction was analyzed by restriction analysis and sequencing. Packaging cells were prepared. The endostatin and interleukin-2 levels were determined by Dot blot. Monocistronic and bicistronic mRNA expression were analyzed by real time RT-PCR. Bicistronic vector showed high levels of virus trites, ranging from 4.20x105 to 1.53x106UFC/mL. Secreted levels of endostatin and interleukin-2 ranged from 1.08 to 2.08μg/106cells.24h and 0.66 - 0.89g/106cells.24h, respectively. The mRNA expression of ES in the NIH3T3 clone pLend-IRES-IL2SN was 2 times higher than the level presented by the NIH3T3 clone pLendSN. The endostatin promoted inhibition (40%) of endothelial cell proliferation. Interleukin-2 promoted a proliferation of 10.6% lymphocytes CD4 and 8.9% of CD8. We conclude that the IRES bicistronic vector provides a powerful tool for studies of cell biology of cancer and new therapeutic strategies.

A síndrome de Knobloch (SK) é uma doença autossômica recessiva rara, caracterizada por problemas oculares e presença de encefalocele occipital, porém o quadro clínico é variável. Os pacientes apresentam principalmente miopia de grau elevado, degeneração vítreo-retiniana e descolamento de retina; o grau de comprometimento da alteração no occipital também é variável. Nossos estudos mostraram que a SK é causada por mutações no gene COL18A1, que codifica o colágeno tipo XVIII. Esse colágeno, uma proteoglicana da matriz extracelular, tem sido estudado principalmente por liberar a endostatina, um fragmento de 20 kDa clivado proteoliticamente de sua porção C-terminal e que possui atividade inibidora da angiogênese. O colágeno XVIII possui três isoformas conhecidas, as quais diferem entre si apenas na porção N-terminal e apresentam padrões de expressão distintos nos tecidos, mesmo estando ubiquamente presentes nas membranas basais epiteliais e endoteliais. Além da endostatina, o colágeno XVIII apresenta outros motivos com funções ainda desconhecidas: um domínio trombospondina, presente em todas as isoformas e um domínio frizzled, encontrado apenas na forma mais longa da proteína. O espectro de variação clinica na SK ainda é incerto, assim como os mecanismos moleculares que levam ao fenótipo. Nosso trabalho teve como objetivos principais a identificação de mutações no COL18A1 em um número maior de famílias com a SK, estabelecimento de novos protocolos que possam auxiliar no diagnóstico clínico e a avaliação do efeito funcional de variações encontradas na endostatina, domínio de maior conservação do colágeno XVIII. Propusemo-nos ainda a identificar proteínas que interagem com o domínio trombospondina. Apresentamos aqui a caracterização de sete novas mutações no colágeno XVIII em pacientes com SK, permitindo assim uma melhor determinação do espectro de variação fenotípica da SK. Com base na identificação dessas mutações pudemos incluir problemas neurológicos nos possíveis sinais clínicos presentes na SK ao apresentar pela primeira vez alterações de migração neuronal em pacientes com a síndrome. A ausência de mutações detectadas em três famílias sugere ainda a existência de heterogeneidade genética na SK. Também propomos neste trabalho a utilização da imunohistoquímica em biópsias de pele como teste diagnóstico para essa doença. Nossos resultados mostram também que a variação A48T da endostatina leva a alterações em sua interação com proteínas da matriz extracelular, enquanto a variação polimórfica D104N, previamente associada ao desenvolvimento de câncer de próstata, não leva a um efeito sobre a interação com as proteínas testadas. E, por último, o método de duplo híbrido não foi eficaz para a identificação de proteínas que possam interagir com o domínio trombospondina do colágeno XVIII. / Knobloch syndrome (KS) is an autosomal recessive disorder characterized by ophthalmological defects and presence of an occipital encephalocele. Clinical variability is present, however, all patients present high grade myopia, vitreoretinal degeneration and in most cases, retinal detachment; the occipital defect is also variable. Studies show that the KS is caused by mutations in COL18A1, the gene that codes for type XVIII collagen. This collagen is an extracellular matrix proteoglycan and has been the focus of a great number of studies due to its C-terminal domain, endostatin. Endostatin is a 20 kDa fragment that is proteolytically cleaved and possesses a high antiangiogenic activity. Type XVIII collagen is known to be expressed in three isoforms, different among themselves in the N-terminal region. These isoforms have distinct expression patterns, but are present in most basement membranes. Besides endostatin, type XVIII collagen also presents other domains with unknown functions: a thrombospondin domain, found in all isoforms; a frizzled domain, present in the longest isoform. The clinical variability spectrum in KS and the molecular mechanisms that lead to the phenotype are still uncertain. The aim of this study was to identify novel mutations in COL18A1 in additional KS families, to develop biochemical diagnostic tests that could allow the screening of a larger number of patients and to evaluate the effect of naturally found variants in the function of endostatin. We also performed a two-hybrid screening in order to identify proteins that can interact with the thrombospondin domain. The characterization of seven novel mutations in KS patients allowed us to better determine the clinical variability of KS. This work shows for the first time the presence of neuronal migration defects in some KS patients. The lack of detected pathogenic mutations in three families led us to propose the genetic heterogeneity of this syndrome. We demonstrate the possibility to use immunohistochemistry in skin biopsies as a diagnosis method. Our results also show the altered properties of T48 endostatin in its interaction with some extracellular matrix proteins. The N104 variant, that has been previously associated with prostate cancer, do not present any change in its interaction to the tested molecules. Finally, the two-hybrid system was not a good method to detect interacting proteins with the thrombospodin domain of collagen XVIII.

A endostatina (ES) é uma proteína inibidora da angiogênese, com ação específica sobre células endoteliais em proliferação, utilizada para tratamento de tumores sólidos. No entanto, o elevado efeito antitumoral da ES observado em animais não é reproduzido em humanos. Com o intuito de potencializar a eficácia terapêutica da ES, produzimos duas proteínas híbridas com dois domínios funcionais. O primeiro domínio é a ES, que apresenta especificidade por células endoteliais ativadas, dirigindo estas proteínas de fusão às células endoteliais em proliferação, promovendo sua internalização e seu efeito inibitório. Como segundo domínio funcional utilizamos os domínios BH3 próapoptóticos de duas proteínas BH3-only com o objetivo de promover a liberação de citocromo C e desencadear o processo de apoptose, aumentando a ação antiangiogênica da ES. Neste trabalho, foram desenhadas duas proteínas de fusão que contêm o domínio BH3 das potentes proteínas pró apoptóticas PUMA e BIM (ES-PUMA e ES-BIM), que deveriam apresentar efeito antiangiogênico potencializado em relação à ES selvagem. A inserção dos fragmentos de DNA codificantes para os domínios BH3 de PUMA e BIM no vetor contendo o gene da ES (pET-ES) foram realizadas por mutagênese sítiodirigida. Estas proteínas de fusão recombinantes foram expressas como corpos de inclusão em E.coli, renaturadas utilizando processo que utiliza alta pressão e purificadas em resina de afinidade por heparina. O tratamento de células endoteliais com as proteínas ES-PUMA e ES-BIM não levou à queda de viabilidade em ensaio de MTS ou de apoptose avaliado por citometria de fluxo, em comparação com os resultados obtidos pelo tratamento com ES. / Endostatin (ES) is an angiogenesis inhibitor protein, with specific effect on proliferating endothelial cells, used to treat solid tumors. However, the high antitumor effect observed in animals is not reproduced in humans. In order to enhance the therapeutic efficacy of ES, we produced two hybrid proteins with two functional domains. The first domain is the ES that is specific for activated endothelial cells, directing the fusion proteins to endothelial cells in proliferation, promoting the internalization and the inhibitory effect. As a second functional domain we used the pro-apoptotic BH3 domains of two BH3-only proteins in order to promote the release of cytochrome C and trigger the apoptosis process, increasing the ES antiangiogenic action. In this work, we produced two fusion proteins containing the BH3 domain of the potent pro-apoptotic proteins BIM and PUMA (PUMA-ES and ES-BIM), which should provide enhanced antiangiogenic effect in relation to ES. The insertion of DNA fragments coding for the BH3 domain and PUMA and BIM in a vector containing ES gene (pETES) was accomplished by site-directed mutagenesis. These recombinant fusion proteins were expressed as inclusion bodies in E. coli, refolded using process at high pressure and purified on heparin affinity resin. Treatment of endothelial cells with ES-PUMA and ES-BIM did not lead to loss in viability in MTS assay or increase of apoptosis evaluated by flow cytometry, in comparison with the results obtained by treatment with ES.

A síndrome de Knobloch (SK) é uma doença autossômica recessiva rara, caracterizada por problemas oculares e presença de encefalocele occipital, porém o quadro clínico é variável. Os pacientes apresentam principalmente miopia de grau elevado, degeneração vítreo-retiniana e descolamento de retina; o grau de comprometimento da alteração no occipital também é variável. Nossos estudos mostraram que a SK é causada por mutações no gene COL18A1, que codifica o colágeno tipo XVIII. Esse colágeno, uma proteoglicana da matriz extracelular, tem sido estudado principalmente por liberar a endostatina, um fragmento de 20 kDa clivado proteoliticamente de sua porção C-terminal e que possui atividade inibidora da angiogênese. O colágeno XVIII possui três isoformas conhecidas, as quais diferem entre si apenas na porção N-terminal e apresentam padrões de expressão distintos nos tecidos, mesmo estando ubiquamente presentes nas membranas basais epiteliais e endoteliais. Além da endostatina, o colágeno XVIII apresenta outros motivos com funções ainda desconhecidas: um domínio trombospondina, presente em todas as isoformas e um domínio frizzled, encontrado apenas na forma mais longa da proteína. O espectro de variação clinica na SK ainda é incerto, assim como os mecanismos moleculares que levam ao fenótipo. Nosso trabalho teve como objetivos principais a identificação de mutações no COL18A1 em um número maior de famílias com a SK, estabelecimento de novos protocolos que possam auxiliar no diagnóstico clínico e a avaliação do efeito funcional de variações encontradas na endostatina, domínio de maior conservação do colágeno XVIII. Propusemo-nos ainda a identificar proteínas que interagem com o domínio trombospondina. Apresentamos aqui a caracterização de sete novas mutações no colágeno XVIII em pacientes com SK, permitindo assim uma melhor determinação do espectro de variação fenotípica da SK. Com base na identificação dessas mutações pudemos incluir problemas neurológicos nos possíveis sinais clínicos presentes na SK ao apresentar pela primeira vez alterações de migração neuronal em pacientes com a síndrome. A ausência de mutações detectadas em três famílias sugere ainda a existência de heterogeneidade genética na SK. Também propomos neste trabalho a utilização da imunohistoquímica em biópsias de pele como teste diagnóstico para essa doença. Nossos resultados mostram também que a variação A48T da endostatina leva a alterações em sua interação com proteínas da matriz extracelular, enquanto a variação polimórfica D104N, previamente associada ao desenvolvimento de câncer de próstata, não leva a um efeito sobre a interação com as proteínas testadas. E, por último, o método de duplo híbrido não foi eficaz para a identificação de proteínas que possam interagir com o domínio trombospondina do colágeno XVIII. / Knobloch syndrome (KS) is an autosomal recessive disorder characterized by ophthalmological defects and presence of an occipital encephalocele. Clinical variability is present, however, all patients present high grade myopia, vitreoretinal degeneration and in most cases, retinal detachment; the occipital defect is also variable. Studies show that the KS is caused by mutations in COL18A1, the gene that codes for type XVIII collagen. This collagen is an extracellular matrix proteoglycan and has been the focus of a great number of studies due to its C-terminal domain, endostatin. Endostatin is a 20 kDa fragment that is proteolytically cleaved and possesses a high antiangiogenic activity. Type XVIII collagen is known to be expressed in three isoforms, different among themselves in the N-terminal region. These isoforms have distinct expression patterns, but are present in most basement membranes. Besides endostatin, type XVIII collagen also presents other domains with unknown functions: a thrombospondin domain, found in all isoforms; a frizzled domain, present in the longest isoform. The clinical variability spectrum in KS and the molecular mechanisms that lead to the phenotype are still uncertain. The aim of this study was to identify novel mutations in COL18A1 in additional KS families, to develop biochemical diagnostic tests that could allow the screening of a larger number of patients and to evaluate the effect of naturally found variants in the function of endostatin. We also performed a two-hybrid screening in order to identify proteins that can interact with the thrombospondin domain. The characterization of seven novel mutations in KS patients allowed us to better determine the clinical variability of KS. This work shows for the first time the presence of neuronal migration defects in some KS patients. The lack of detected pathogenic mutations in three families led us to propose the genetic heterogeneity of this syndrome. We demonstrate the possibility to use immunohistochemistry in skin biopsies as a diagnosis method. Our results also show the altered properties of T48 endostatin in its interaction with some extracellular matrix proteins. The N104 variant, that has been previously associated with prostate cancer, do not present any change in its interaction to the tested molecules. Finally, the two-hybrid system was not a good method to detect interacting proteins with the thrombospodin domain of collagen XVIII.

A endostatina (ES) é uma proteína inibidora da angiogênese, com ação específica sobre células endoteliais em proliferação, utilizada para tratamento de tumores sólidos. No entanto, o elevado efeito antitumoral da ES observado em animais não é reproduzido em humanos. Com o intuito de potencializar a eficácia terapêutica da ES, produzimos duas proteínas híbridas com dois domínios funcionais. O primeiro domínio é a ES, que apresenta especificidade por células endoteliais ativadas, dirigindo estas proteínas de fusão às células endoteliais em proliferação, promovendo sua internalização e seu efeito inibitório. Como segundo domínio funcional utilizamos os domínios BH3 próapoptóticos de duas proteínas BH3-only com o objetivo de promover a liberação de citocromo C e desencadear o processo de apoptose, aumentando a ação antiangiogênica da ES. Neste trabalho, foram desenhadas duas proteínas de fusão que contêm o domínio BH3 das potentes proteínas pró apoptóticas PUMA e BIM (ES-PUMA e ES-BIM), que deveriam apresentar efeito antiangiogênico potencializado em relação à ES selvagem. A inserção dos fragmentos de DNA codificantes para os domínios BH3 de PUMA e BIM no vetor contendo o gene da ES (pET-ES) foram realizadas por mutagênese sítiodirigida. Estas proteínas de fusão recombinantes foram expressas como corpos de inclusão em E.coli, renaturadas utilizando processo que utiliza alta pressão e purificadas em resina de afinidade por heparina. O tratamento de células endoteliais com as proteínas ES-PUMA e ES-BIM não levou à queda de viabilidade em ensaio de MTS ou de apoptose avaliado por citometria de fluxo, em comparação com os resultados obtidos pelo tratamento com ES. / Endostatin (ES) is an angiogenesis inhibitor protein, with specific effect on proliferating endothelial cells, used to treat solid tumors. However, the high antitumor effect observed in animals is not reproduced in humans. In order to enhance the therapeutic efficacy of ES, we produced two hybrid proteins with two functional domains. The first domain is the ES that is specific for activated endothelial cells, directing the fusion proteins to endothelial cells in proliferation, promoting the internalization and the inhibitory effect. As a second functional domain we used the pro-apoptotic BH3 domains of two BH3-only proteins in order to promote the release of cytochrome C and trigger the apoptosis process, increasing the ES antiangiogenic action. In this work, we produced two fusion proteins containing the BH3 domain of the potent pro-apoptotic proteins BIM and PUMA (PUMA-ES and ES-BIM), which should provide enhanced antiangiogenic effect in relation to ES. The insertion of DNA fragments coding for the BH3 domain and PUMA and BIM in a vector containing ES gene (pETES) was accomplished by site-directed mutagenesis. These recombinant fusion proteins were expressed as inclusion bodies in E. coli, refolded using process at high pressure and purified on heparin affinity resin. Treatment of endothelial cells with ES-PUMA and ES-BIM did not lead to loss in viability in MTS assay or increase of apoptosis evaluated by flow cytometry, in comparison with the results obtained by treatment with ES.