Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Detecta la presencia de tripanosomátidos y Trypanosoma cruzi en sangre de primates no humanos mantenidos en cautiverio, mediante PCR anidada. Para realizar la identificación por PCR de T. cruzi en primates no humanos, se optimiza un protocolo anidado usando dos pares de cebadores dirigidos al gen 24S alfa de la subunidad mayor de ribosoma. Se analizan muestras de sangre de mono colectadas en tubos con EDTA y tarjetas FTA provenientes de siete ciudades peruanas: Yurimaguas (n=69), Pucallpa (n=29), Puerto Maldonado (n=26), Iquitos (n=1), Moyobamba (n=17), Lima (n=34), y Cuzco (n=18). Las muestras son colectadas entre noviembre 2011 y mayo 2012 por la ONG Wildlife Conservation Society (WCS) mediante un muestreo no probabilístico por conveniencia. De cada muestra también se realizan frotis y gota gruesas para detección de hemoparásitos por microscopía. Los productos de amplificación de la primera reacción son de aproximadamente 240-280 pb y amplificaron secuencias conservadas en todos los tripanosomátidos, mientras que los de la segunda PCR son de 110-130 pb y amplifican una secuencia interna, exclusiva de T. cruzi. No se observa una reacción cruzada con ADN de mamífero (Aotus, humanos) ni con otros parásitos como Plasmodium spp. El límite de detección del protocolo es de 1,5 pg de ADN para tripanosomátidos y de 15 fg para T. cruzi; lo que equivale aproximadamente a 4,5 y 0,045 parásitos, respectivamente. Sin embargo, como la cantidad de ADN de T. cruzi varía entre cepas y clones, este rango podría ser más amplio y detectar solo 12,5 parásitos en la primera reacción y 0,12 en la segunda. Al comparar la PCR con el diagnóstico por microscopía, se determina que esta última es menos específica (97,96%) y sensible (82,86%). Finalmente, al emplear el protocolo de PCR en las muestras de primates no humanos, se encuentra que la prevalencia de tripanosomátidos es de 26,49% y la de T. cruzi 3,24%. / Tesis

Desarrolla micropartículas modificadas de quitosano con capacidad de adsorción de ácido desoxirribonucleico (ADN) para diagnóstico molecular de la enfermedad de Chagas. Se sintetizaron y caracterizaron diferentes micropartículas de quitosano, se optimizó la condiciones de adsorción de ADN in vitro evaluando parámetros (tipo, pH del medio, concentración, tiempo y el método de desorción). Se determinó, el límite de detección de ADN plasmídico y ADN de T.cruzi. Se evaluó la sensibilidad y especificidad en la detección de ADN del kinetoplasto (ADNk) - 71P y ADN satélite (ADNsat) - C3 en muestras de orina obtenidas a los 14 y 45 días postinfección (dpi) en animales experimentalmente. Los resultados mostraron que las micropartículas de quitosano entrecruzadas (QE) tienen mayor capacidad de adsorción de ADN. Se establecieron los siguientes parámetros óptimos; concentración de entrecruzante al 1%, el pH del medio a 6.9, tiempo de 60 minutos y el método de desorción EDTA-SDS. El límite de detección del ADN plasmídico fue de 101 copias/mL y del ADN de T. cruzi de 10-1 parásitos/mL. La sensibilidad fue mayor en la detección del ADNk con 71 %, con la región del ADNsat alcanzó 25%. La sensibilidad a los 14 dpi fue de 42 % en la detección de la región del ADNsat y 78% con la región del ADNk; a los 45 dpi fue de 7 %y 64% con la región de satélite del ADNsat y región del ADNk respectivamente. Se demostró la alta especificidad (100%) para ambas regiones. El método desarrollado es innovador, las micropartículas de QE tienen la capacidad de aislar y concentrar el ADN de T.cruzi en muestras de orina y podría usarse como biomarcador para el diagnóstico no invasivo de Chagas. / Tesis

Menciona que Leishmania braziliensis es un protozoario causante de la leishmaniasis o uta, enfermedad endémica crónica de baja patogenicidad, alta morbilidad, metaxénica y zoonótica que compromete piel, mucosas y vísceras. Es transmitida por un díptero del género Lutzomyia, afecta alrededor de 12 millones de personas alrededor del mundo y a 12 departamentos en el Perú. Leishmania braziliensis tiene patrones moleculares de membrana asociadas a patógenos que son reconocidos por los receptores tipo toll (TLR) presentes en el hospedero, tanto en la superficie celular como a nivel intracelular. Los TLRs están conformados por una familia de 23 tipos que van a reconocer ligandos presentes en patógenos en común. Cuando se da la unión del ligando con un TLR desencadenará una secuencia de señales activando la expresión de moléculas coestimuladoras y citoquinas promoviendo una inflamación y activando la respuesta adaptativa. El presente trabajo tiene como objetivos caracterizar a la cepa C234 de Leishmania braziliensis mediante secuenciamiento y detectar y cuantificar los niveles de expresión de mRNA de los genes TLR-3, TLR-4 y TLR-9 y de las citoquinas IL-12 y TNF-α en macrófagos murinos enfrentados a la cepa C234 de Leishmania braziliensis, endémica del Perú. Se infectó macrófagos peritoneales de ratones Balb/c con promastigotes de Leishmania braziliensis y se cultivaron por 24 horas, se midió los niveles de óxido nítrico (ON), se extrajo mRNA de los macrófagos y se detectó y cuantificó los niveles de expresión en los genes de TLR-3, TLR- 4 y TLR-9, y de las citoquinas proinflamatorias IL-12 y TNF-α, a través de la técnica de retrotranscripción mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los resultados indicaron que el estudio filogenético de la cepa C234 mostró alta homología (96%) para Leishmania braziliensis. Además, los macrófagos infectados con Leishmania braziliensis presentaron mayor producción de ON sólo en las primeras horas de infección, descendiendo a las 24 y 48 horas; y se detectó expresión de mRNA para los genes TLR-3, TLR-4 y TLR-9 y de las citoquinas IL-12 y TNF-α. Se concluye que la cepa nativa C234 pertenece a la especie Leishmania braziliensis y que la disminución de la producción de ON está relacionada al mayor tiempo de infección y bajos niveles de expresión del gen TLR-4, así mismo, el incremento del nivel de expresión de mRNA de los genes TLR-3 y TLR-9 podrían estar implicados en la activación de la expresión génica de la citoquina IL-12 en macrófagos peritoneales murinos infectados con Leishmania braziliensis. / Tesis