Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-11-08T11:10:03Z No. of bitstreams: 1 GabrielaCarneirodeAlmeidaDissertacao2017.pdf: 2560464 bytes, checksum: e83aefbc8d589156cb3d5cb06b98ffcb (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-11-08T11:10:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 GabrielaCarneirodeAlmeidaDissertacao2017.pdf: 2560464 bytes, checksum: e83aefbc8d589156cb3d5cb06b98ffcb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T11:10:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GabrielaCarneirodeAlmeidaDissertacao2017.pdf: 2560464 bytes, checksum: e83aefbc8d589156cb3d5cb06b98ffcb (MD5) Previous issue date: 2017-08-08 / Growing concern about the environment has been encouraging the industry to seek more sustainable production processes. Although conversion of renewable substrates into chemicals can be performed through chemical reactions, it is more commonly done by microorganisms through fermentation processes. L-rhamnose (6-deoxy-L-rhamnose) is a sugar with the potential to become a chemical platform since it can be used in a range of industrial sectors as a precursor for artificial flavors and even as a cosmetic component. This sugar has a difficult plants cell walls extracting process, a fact that makes its production on a massive scale economically unfeasible. One source for L-rhamnose would be the hydrolysis of the rhamnolipid molecule. Rhamnolipids are biosurfactants of the glycolipids class produced by Pseudomonas aeruginosa, a pathogenic bacterium that increases the production process. This surfactant also has industrial applicability due to its amphipathic nature. In this study, for the first time, the genes that encodes the enzymes of the synthesis of dTDP-L-rhamnose of P. aeruginosa from glucose-1-phosphate (RmlA, RmlB, RmlC and RmlD) were transferred to Saccharomyces cerevisiae. Futhermore, a gene that encodes a sucrose phosphorylase responsible for hydrolyzing sucrose into glucose-1-phosphate and fructose was also inserted into the yeast in order to maximize the conversion of sucrose to L-rhamnose. After the recombinant strains construction, only RmlA activity was detected. However, dTDP-L-rhamnose was detected by mass spectrometry. Transcriptional analyses have shown that there are detectable transcripts for RmlA, RmlB and RmlD, but there are no detectable transcripts for sucrose ??? phosphorylase and RmlC. In this context, it is likely that the plasmid containing these genes is instable or that the mRNA molecules for the same genes are instable, resulting in a low expression for the enzymes for sucrose ??? phosphorylase and RmlC. A more detailed metabolic study of the strains should help identify bottlenecks around the production of this molecule, facilitating the metabolic engineering design to increase its production. The final strains will later be the basis of construction for the development of a S. cerevisiae rhamnolipid producing strain. / A crescente preocupa????o com o meio ambiente vem incentivando a busca por processos produtivos mais sustent??veis. A convers??o de substratos renov??veis em produtos qu??micos pode ser feita por s??ntese qu??mica, por??m, ?? mais comumente feita por microrganismos atrav??s de processos fermentativos. A L-ramnose (6-deoxi-L-ramnose) ?? um a????car com potencial para se tornar um qu??mico de base, j?? que pode ser usada em diversos setores industriais, como precursor para aromas artificiais e at?? como componente de cosm??ticos. Esse a????car tem um dif??cil processo de extra????o da parede celular de plantas, fato que torna sua produ????o em larga escala economicamente invi??vel. Uma fonte para L-ramnose seria a hidr??lise da mol??cula de ramnolip??deo. Rhamnolip??deos s??o biossurfactantes da classe dos glicolip??deos produzidos por Pseudomonas aeruginosa, uma bact??ria patog??nica que aumenta os custos do processo de produ????o devido a coprodu????o com toxinas. Esse surfactante tamb??m possui aplicabilidade industrial devido a sua natureza anfip??tica. Neste estudo, pela primeira vez, os genes que codificam as enzimas da via de s??ntese de dTDP-L-ramnose de P. aeruginosa a partir de glicose-1-fosfato (RmlA, RmlB, RmlC e RmlD) foram transferidos para Saccharomyces cerevisiae. Al??m disso, um gene que codifica uma sacarose fosforilase respons??vel por hidrolisar sacarose em glicose-1-fosfato e frutose, tamb??m foi inserido na levedura com a finalidade de maximizar a convers??o de sacarose a L-ramnose. Ap??s a constru????o das cepas recombinantes, apenas a atividade enzim??tica de RmlA foi detectada. No entanto, a mol??cula dTDP-L-ramnose foi detectada por espectrometria de massa. An??lises de transcri????o mostraram que h?? transcritos detect??veis para os genes codificadores de RmlA, RlmB e RmlD, mas n??o para os genes de sacarose fosforilase e RmlC. Nesse contexto, ?? prov??vel que o plasm??deo que cont??m esses genes ?? inst??vel ou que os mRNAs para esses mesmos genes sejam inst??veis, resultando na baixa produ????o das enzimas sacarose fosforilase e RmlC. Um estudo metab??lico mais detalhado das cepas deve ajudar a identificar os gargalos em torno da produ????o dessa mol??cula, facilitando o delineamento de engenharia metab??lica para aumentar sua produ????o. As cepas finais s??o base para o estabelecimento industrial da produ????o de ramnolip??deos em S. cerevisiae.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaKCL_TESE.pdf: 1692215 bytes, checksum: a7d6bf1b824b71e2d8f2ccfcbbe55015 (MD5) Previous issue date: 2010-04-09 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Metabolic flux analysis (MFA) is a powerful tool for analyzing cellular metabolism. In order to control the growth conditions of a specific organism, it is important to have a complete understanding of its MFA. This would allowed us to improve the processes for obtaining products of interest to human and also to understand how to manipulate the genome of a cell, allowing optimization process for genetic engineering. Streptomyces olindensis ICB20 is a promising producer of the antibiotic cosmomycin, a powerful antitumor drug. Several Brazilian researchers groups have been developing studies in order to optimize cosmomycin production in bioreactors. However, to the best of our knowledge, nothing has been done on metabolic fluxes analysis field. Therefore, the aim of this work is to identify several factors that can affect the metabolism of Streptomyces olindensis ICB20, through the metabolic flux analysis. As a result, the production of the secondary metabolite, cosmomycin, can be increased. To achieve this goal, a metabolic model was developed which simulates a distribution of internal cellular fluxes based on the knowledge of metabolic pathways, its interconnections, as well as the constraints of microorganism under study. The validity of the proposed model was verified by comparing the computational data obtained by the model with the experimental data obtained from the literature. Based on the analysis of intracellular fluxes, obtained by the model, an optimal culture medium was proposed. In addition, some key points of the metabolism of Streptomyces olindensis were identified, aiming to direct its metabolism to a greater cosmomycin production. In this sense it was found that by increasing the concentration of yeast extract, the culture medium could be optimized. Furthermore, the inhibition of the biosynthesis of fatty acids was found to be a interesting strategy for genetic manipulation. Based on the metabolic model, one of the optimized medium conditions was experimentally tested in order to demonstrate in vitro what was obtained in silico. It was found that by increasing the concentration of yeast extract in the culture medium would induce to an increase of the cosmomycin production / A an?lise de fluxos metab?licos (AFM) ? uma importante ferramenta de an?lise do metabolismo celular. O seu conhecimento ? de extrema import?ncia para entender como deve ser conduzido ?s condi??es de cultivo de um organismo, no sentido de melhorar os processos de obten??o de produtos de interesse do homem, bem como para entender como deve ser manipulado o genoma de uma c?lula possibilitando a otimiza??o do processo para engenharia gen?tica. Streptomyces olindensis ICB20 ? um promissor produtor do antibi?tico cosmomicina, uma potente droga antitumoral, sendo de extrema relev?ncia estudar os fluxos metab?licos deste micro-organismo com o prop?sito de otimizar a s?ntese deste produto do metabolismo secund?rio. V?rios grupos de pesquisa brasileiros v?m desenvolvendo estudos na tentativa de otimizar esta produ??o em biorreatores. Entretanto, nada foi realizado ainda relativo ? an?lise de fluxos metab?licos. Este trabalho teve como objetivo verificar os fatores que afetam o metabolismo de Streptomyces olindensis ICB20, atrav?s da an?lise de fluxos metab?licos de forma que possa ser aumentada a produ??o do metab?lito secund?rio, cosmomicina. Para alcan?ar esse objetivo foi desenvolvido um modelo metab?lico que simula uma distribui??o dos fluxos internos celulares com base no conhecimento das vias metab?licas, de suas interliga??es, como tamb?m das restri??es do micro-organismo em estudo. A validade do modelo proposto foi verificada atrav?s da compara??o dos dados obtidos pelo modelo com dados experimentais da literatura. A partir da an?lise dos fluxos intracelulares, obtidos pelo modelo, foi proposto um meio de cultivo ?timo, como tamb?m, identificado pontos chaves do metabolismo com o direcionando o metabolismo de Streptomyces olindensis para uma maior produ??o de cosmomicina. Nesse sentido foi verificado que o incremento na concentra??o de extrato de levedura ? uma proposta de otimiza??o do meio de cultivo e que a inibi??o da via biossint?tica de ?cidos graxos ? uma estrat?gia interessante para manipula??o gen?tica. Com o objetivo de comprovar in vitro o que foi obtido in silico foi testada uma das condi??es de otimiza??o de meio proposta pelo modelo metab?lico atrav?s de ensaios experimentais em incubador rotativo onde foi constatado que o incremento na concentra??o de extrato de levedura no meio de cultivo induziu a um aumento na produ??o de cosmomicina