Cronobacter species cause serious infections such as meningitis and enteritis in newborns and neonates, with the major vehicle being contaminated powdered infant formula. The main objectives of this study were i) to identify potential virulence factors, such as enterotoxin production; ii) characterize the gene(s) involved in adhesion and invasion of the human brain microvascular endothelial cells (HBMEC); and iii) determine whether strains from clinical, food, and environmental sources differ in their ability to produce surface-attached bacterial aggregates, known as biofilms. Random transposon mutagenesis was used on strains demonstrating the best adherence and invasion to blood- brain barrier cell lines (BBB). Isogenic mutants were then screened for increased or decreased adherence and invasion. Screening of the transposon library identified one isogenic mutant of a clinical strain which lost the ability to adhere to BBB cells. The transposon rescue revealed the insertion site to be within a diguanylate cyclase (DGC) gene. The major function of DGC in many Gram-negative bacteria is to synthesize cyclic diguanylate (c-di-GMP), a secondary bacterial metabolite known for regulating biofilm formation, motility, and virulence or aspects of microbial pathogenicity. Based on the findings of this study, DGC appears to play an important role in Cronobacter species’ ability to produce biofilms and may also have a role of the pathogenicity in the microorganism.

Cronobacter species cause serious infections such as meningitis and enteritis in newborns and neonates, with the major vehicle being contaminated powdered infant formula. The main objectives of this study were i) to identify potential virulence factors, such as enterotoxin production; ii) characterize the gene(s) involved in adhesion and invasion of the human brain microvascular endothelial cells (HBMEC); and iii) determine whether strains from clinical, food, and environmental sources differ in their ability to produce surface-attached bacterial aggregates, known as biofilms. Random transposon mutagenesis was used on strains demonstrating the best adherence and invasion to blood- brain barrier cell lines (BBB). Isogenic mutants were then screened for increased or decreased adherence and invasion. Screening of the transposon library identified one isogenic mutant of a clinical strain which lost the ability to adhere to BBB cells. The transposon rescue revealed the insertion site to be within a diguanylate cyclase (DGC) gene. The major function of DGC in many Gram-negative bacteria is to synthesize cyclic diguanylate (c-di-GMP), a secondary bacterial metabolite known for regulating biofilm formation, motility, and virulence or aspects of microbial pathogenicity. Based on the findings of this study, DGC appears to play an important role in Cronobacter species’ ability to produce biofilms and may also have a role of the pathogenicity in the microorganism.

Cronobacter species cause serious infections such as meningitis and enteritis in newborns and neonates, with the major vehicle being contaminated powdered infant formula. The main objectives of this study were i) to identify potential virulence factors, such as enterotoxin production; ii) characterize the gene(s) involved in adhesion and invasion of the human brain microvascular endothelial cells (HBMEC); and iii) determine whether strains from clinical, food, and environmental sources differ in their ability to produce surface-attached bacterial aggregates, known as biofilms. Random transposon mutagenesis was used on strains demonstrating the best adherence and invasion to blood- brain barrier cell lines (BBB). Isogenic mutants were then screened for increased or decreased adherence and invasion. Screening of the transposon library identified one isogenic mutant of a clinical strain which lost the ability to adhere to BBB cells. The transposon rescue revealed the insertion site to be within a diguanylate cyclase (DGC) gene. The major function of DGC in many Gram-negative bacteria is to synthesize cyclic diguanylate (c-di-GMP), a secondary bacterial metabolite known for regulating biofilm formation, motility, and virulence or aspects of microbial pathogenicity. Based on the findings of this study, DGC appears to play an important role in Cronobacter species’ ability to produce biofilms and may also have a role of the pathogenicity in the microorganism.

Onemocnění z potravin (alimentární onemocnění) vyvolaná bakteriemi jsou stále aktuálním tématem v celosvětovém měřítku. Abychom zajistili výrobu zdravotně nezávadných potravin, je potřeba nových poznatků o virulenci patogenů, které by doplnily již známé skutečnosti o jejich růstu a přeživání v potravinách. Také potřebujeme vyvíjet rychlé a citlivé metody na detekci těchto patogenů. Dizertační práce popisuje metodu na detekci S. aureus v potravinách, která je založená na PCR v reálném čase ve spojení s namnožením v selektivním médium. Dále pojednává o vlivu environmentálních faktorů na růst S. aureus a tvorbu enterotoxinů v mléce a sýrech. Vyvinuli jsme rychlou a citlivou metodu na detekci S. aureus v potravinách s použitím selektivního namnožení a PCR v reálném čase. Nově vyvinutá metoda umožnila detekci S. aureus na druhý den od přijetí vzorku. Tato metoda může být použita jako rychlejší, citlivějsí a vysoce specifická alternativní metoda ke konvenční mikrobiologické metodě. Zkoumali jsme vliv tří různých teplot, 8°C, 12°C a 20°C na růst S. aureus a tvorbu enterotoxinu D v pasterizovaném mléce a na růst, expresi genu sed a tvorbu enterotoxinu D v tekutém médiu s extraktem z mozku a srdce (BHI). Experimenty byly prováděny v malých skleněných fermentorech po 6 dní. Genová exprese byla sledována pomocí qRT-PCR a tvorba enterotoxinu D byla měřena pomocí imunologické metody ELISA. Růstová křivka v BHI měla stejný průběh při 20°C a 12°C, ale v při 12°C začal růst se spožděním. Při 8°C nebyl pozorován žádný růst. Růst S. aureus v mléce byl ve srovnání s BHI menší. sed mRNA byla detekována při 20°C po 4 hodinách a při 12°C po 7 hodinách a produkce enterotoxinu se objevila v exponenciální fázi růstu. V mléce se produkce SED při 20°C a při 12°C objevila dříve, ale celkové množství vyprodukovaného SED bylo nižší než v BHI. Při 8°C nebyla pozorována žádná produkce SED stejně jako v BHI. Dále byl zkoumán společný vliv nízké teploty 12°C a přítomnosti kompetitivní doprovodné mikroflóry pocházející ze surového mléka na růst S. aureus a produkci enterotoxinu v pasterizovaném mléce. Byl pozorován inhibiční účinek na růst a produkci enterotoxinů a vliv kompetice byl výraznější než vliv nízké teploty. Produkce enterotoxinu byla nízká a odpovídala růstu. Snížením množství doprovodné mikroflóry a zvýšením inokula došlo pouze k nepatrnému zvýšení produkce enterotoxinu. V další fázi byly dva různé typy sýrů zaočkovány S. aureus za účelem simulace sekundární kontaminace při výrobě sýrů. Vzorky byly odebírány v průběhu 4 týdnů. Kritické faktory jako jsou kompetitivní mikrofóra nebo pH, které jsou zodpovědné za regulaci virulence S. aureus byly sledovány. Snažili jsem se rozlišit situace při kterých: (i) není pozorován růst, ale objevuje se produkce enterotoxinu a (ii) dochází k růstu ale bez produkce enterotoxinu.