Le Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire est impliqué dans un grand nombre de processus biologiques chez toutes les cellules de l’organisme. Chez les cellules non-excitables, les protéines TRPC, pour transient receptor potentiel canonical, situées à la membrane plasmique, sont des canaux calciques impliqués dans l’entrée de calcium. TRPC6 est particulièrement étudiée vu son implication potentielle dans plusieurs problèmes pathologiques. La glomérulosclérose focale et segmentale (FSGS) qui est une maladie dérégulant le système de filtration du rein, l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique (IPAH), caractérisé par une élévation anormale et sporadique de la pression sanguine au niveau des artères pulmonaires, ainsi que dans certains cancers. Ses modes et mécanismes d’activation ainsi que sa régulation sont encore aujourd’hui très peu connus, malgré les nombreuses recherches menées. Le but de la présente étude est d'investiguer la régulation de TRPC6 via son ubiquitination. L’ubiquitination des protéines, processus étudié depuis longtemps, a été démontré pour moduler l’activité de plusieurs protéines et réguler leur localisation cellulaire et membranaire. Nos travaux démontrent, que l’état d'ubiquitination de TRPC6 est modulé et favorisé par une stimulation avec des agonistes du canal TRPC6 , tel que le CCh et la Tg. L’utilisation d’inhibiteurs des différentes voies de dégradation utilisant l’ubiquitine comme moyen de régulation, nous permet de démontrer que l’ubiquitination de TRPC6 se fait suivant son internalisation. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’implication de Rabex-5, un facteur d’échange de nucléotide guanylique (GEF) de Rab5 qui se lie aux protéines membranaire ubiquitinylées. Nous démontrons une interaction entre TRPC6 et Rabex-5. Cette interaction n’a aucune influence sur l’activité de TRPC6. De plus, nous démontrons que l’activité GEF de Rabex-5 n’est pas nécessaire à cette interaction et n’influence pas l’activité du canal TRPC6 . Cette étude a permis de déterminer que TRPC6 est un canal ubiquitinylé, que cette ubiquitination se fait suivant son internalisation et est modulée par certains agonistes, tel que le CCh et la Tg. Sans que cette dernière ne soit impliquée dans l’activité fonctionnelle du canal, nous démontrons également une interaction entre TRPC6 et Rabex-5, une protéine localisée au niveau des endosomes précoces. Cette étude est un premier pas vers la compréhension de la régulation via l’ubiquitination, pour le canal TRPC6.

Intracellular Ca[superscript 2+] is involved in many biological processes in all cells throughout the organism. In non excitable cells, TRPC proteins located at the plasma membrane are calcium channels involved in calcium entry. TRPC6 is particularly studied since its implication in many pathologies, as FSGS, IPAH and some cancers. Its activation and regulation modes and mechanisms are yet fully understood, in spite of the intense research. The purpose of the present study is to investigate the regulation of TRPC6 by phosphorylation. For this, we used metabolic labeling and videomicroscopy techniques in order to evaluate direct TRPC6 phosphorylation and activity. We hence identified a basal as well as a PKC-dependent phosphorylation on TRPC6. PKC is known to modulate the activity of TRPC1, TRPC3, TRPC4 and TRPC5. Recent studies also showed that TRPC6 is inhibited by PKC. Our first study confirms that activation of PKC leads to TRPC6 activity inhibition. When using GF1, a specific PKC inhibitor, calcium entry in TRPC6-expressing cells is potentiated. We moreover show that TRPC6 is phosphorylated following PKC activation. We identify the serine at position 448 as being phosphorylated and responsible for the PKC-mediated inhibition. The S448A mutant of TRPC6 is no longer phosphorylated nor inhibited by PKC. This first study thus demonstrates that PKC-dependent phosphorylation of serine 448 of TRPC6 mediates channel inhibition. In the second study, we investigate the basal phosphorylation of TRPC6, which was observed in the first study. Mass spectrometry analysis identified serine 814 as being potentially phosphorylated, a fact confirmed by metabolic labeling assays performed on the S814A mutant of TRPC6. We show that the S814A mutation does not affect TRPC6 activity. Even though the S814 is in a consensus CK2 phosphorylation sequence, we also show that CK2 is not involved in the phosphorylation or the regulation of TRPC6. These studies thus led to the identification of two new phosphorylations on TRPC6, serine 448 and 814. We also characterized the mechanism by which PKC regulates TRPC6.