La recrudescence de la tuberculose et l'apparition des souches de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) résistantes aux antibiotiques souligne la nécessité de rechercher de nouveaux antituberculeux avec de nouveaux mécanismes d'action. Les mycobactéries possèdent une membrane externe (appelée aussi mycomembrane), très riche en lipides qui leur confère une imperméabilité remarquable. Les constituants majeurs de la mycomembrane sont des acides gras originaux et à très longue chaine, appelés acides mycoliques (AMs). La biosynthèse de ces AMs est essentielle à la croissance mycobactérienne et comporte des enzymes-clefs, dont nombreuses ont été validées comme des cibles prometteuses pour la recherche de nouveaux antituberculeux. Parmi elles, FadD32, une Fatty-acyl AMP Ligase impliquée dans l'étape ultime de cette voie de biosynthèse. Si les propriétés physico-chimiques de l'enzyme ont été caractérisées, la régulation de l'activité de cette enzyme essentielle reste encore à découvrir. La première partie de cette thèse porte sur la mise en évidence de la régulation post-traductionnelle par phosphorylation de FadD32 par des Sérine/Thréonine Protéine Kinases (STPKs) de type eucaryote. Nous avons montré que FadD32 pouvait être phosphorylée in vitro par plusieurs STPKs de Mtb. Cette phosphorylation réversible module négativement l'activité de la protéine, comme démontré pour d'autres protéines de la voie de biosynthèse des AMs. Afin de mieux comprendre l'impact de la phosphorylation par STPK sur la production des AMs et sur la synthèse de la mycomembrane, nous avons surexprimé une STPK de Mtb chez M. smegmatis, espèce modèle des mycobactéries. Nous avons pu observer un changement significatif de la quantité des AMs. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons optimisé et réalisé le criblage biochimique d'une chimiothèque sur l'activité de FadD32 et avons identifié des touches qui devraient servir dans la recherche de nouveaux agents antituberculeux. / The resurgence of tuberculosis (TB), together with the emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), highlights the need for new anti-TB drugs with novel mechanisms of action. Mycobacteria possess an outer membrane (also called mycomembrane), which confers to them a remarkably impermeable cell envelope. The major constituents of the mycomembrane are very long-chain fatty acids with original structures, the so-called mycolic acids (MAs). The biosynthesis of MAs is essential for mycobacterial growth and involves several key enzymes, many of which have been validated as promising anti-TB drug targets. Among them, FadD32, a Fatty-acyl AMP Ligase implicated in the last step of the biosynthesis pathway, has been characterized biochemically and its protein structure has been solved recently. However, the regulation aspect of the enzyme is still to be deciphered. The first part of the thesis focuses on the post-translational regulation by protein phosphorylation of FadD32 by eukaryotic-like Serine/Threonine Protein Kinases (STPKs). We showed that FadD32 is the substrate of several Mtb STPKs. The reversible phosphorylation negatively modulates the adenylation activity of the protein. In order to determine the impact of the post-translational regulation on MA production, we over-expressed a STPK of Mtb in M. smegmatis, a validated surrogate of Mtb. We observed a significant change in the amounts of MAs. In the second part of the thesis, we screened a chemical library against FadD32 and identified several hits that should help in the development of new anti-TB agents.