Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.

O aumento na prevalência da tuberculose (TB), a emergência de cepas resistentes a múltiplas drogas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da TB, e o efeito devastador da coinfecção pelo HIV têm enfatizado a urgente necessidade no desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. A análise completa da seqüência genômica do M. tuberculosis H37Rv mostrou a existência de genes envolvidos na via de biossíntese de aminoácidos aromáticos, a via do chiquimato, e evidências experimentais indicam que esta via é essencial para o M. tuberculosis e apresenta-se ausente no homem. Os produtos dos genes que são essenciais para o crescimento dos microrganismos fazem deles alvos atrativos para a ação de drogas, pois a inibição de sua função pode matar o bacilo. Previamente, nosso grupo relatou a clonagem do gene aroE de M. tuberculosis e a expressão do seu produto na forma solúvel, a enzima chiquimato desidrogenase (MtbSD), que catalisa o quarto passo na via do chiquimato. Neste trabalho apresentamos, no primeiro artigo, intitulado “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, a purificação da MtbSD solúvel e ativa por cromatografia líquida, o seqüenciamento do Nterminal, a espectrometria de massas, a determinação do estado oligomérico por cromatografia em gel filtração, a estabilidade térmica, a determinação de parâmetros cinéticos aparentes em estado estacionário para as reações direta e reversa, a constante de equilíbrio aparente e energia de ativação para a reação química catalisada pela MtbSD. No segundo artigo, intitulado “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, descrevemos os parâmetros de velocidade inicial na reação direta, os estudos de inibição pelos produtos, os efeitos isotópicos cinéticos primários do deutério, os efeitos isotópicos cinéticos do solvente, os efeitos isotópicos cinéticos múltiplos, proton inventory, o efeito de pH na química ácido/base para a ligação e catálise dos substratos, e a estrutura 3D da MtbSD obtida in silicon pela modelagem por homologia. Esses resultados servem como base para os estudos cinéticos e estruturais que podem auxiliar no desenho racional de inibidores a serem testados como agentes antimicobacterianos. / The increasing prevalence of tuberculosis (TB), the emergence of multidrug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and the devastating effect of coinfection with HIV have highlighted the urgent need for the development of new antimycobacterial agents. Analysis of the complete genome sequence of M. tuberculosis H37Rv shows the presence of genes involved in the aromatic amino acid biosynthetic pathway, the shikimate pathway, and experimental evidence showed that this pathway is essential for M. tuberculosis and it is absent in humans. The gene products that are essential for the growth of the microorganisms make them attractive drug targets since inhibiting their function may kill the bacilli. Our group has previously reported the cloning of M. tuberculosis aroE gene and the expression of the product in the soluble form, the shikimate dehydrogenase (MtbSD) enzyme, that catalysis the fourth reaction in the shikimate pathway. Currently, in the first manuscript “Functional shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: purification and characterization”, we present the purification of soluble and active MtbSD, N-terminal sequencing, mass spectrometry, assessment of the oligomeric state by gel filtration chromatography, thermal stability, determination of apparent steady-state kinetic parameters for both forward and reverse directions, apparent equilibrium constant, and energy of activation for the enzyme-catalyzed chemical reaction. In the second manuscript “Shikimate Dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Kinetic and Chemical Mechanisms”, we describe the kinetic mechanism, initial velocity patterns in the forward direction, product inhibition studies, primary deuterium kinetic isotope effects, solvent kinetic isotope effects, multiple isotope effects, proton inventory, pH rate profile and the MtbSD 3D structure obtained in silicon by homology modeling. These results should be useful as a solid base for structural and kinetic studies, which can aid in the rational design of inhibitors to be tested as antimycobacterial agents.

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.