L’autisme est une pathologie neurodéveloppementale impliquant des facteurs génétiques. Nous utilisons une stratégie d’étude de gènes candidats choisis pour leur rôle clé dans la voie de l’ubiquitine, impliquée dans des mécanismes de neurogénèse ou de plasticité synaptique mis en cause dans l’autisme.L’identification des 37 enzymes de conjugaison à l’ubiquitine E2 humaines, groupées en 17 familles, a permis de sélectionner 6 enzymes pour mener une recherche de mutation chez 195 autistes : UBE2H, UBE2A, UBE2K, UBE2I, UBE2N, UBE2E3.Aucune mutation n’a été détectée dans notre population d’autistes, et aucune preuve génétique n’a pu impliquer les gènes UBE2K, UBE2A et UBE2N. En revanche des associations significatives ont été mises en évidence avec des polymorphismes des gènes UBE2E3, UBE2I et UBE2H.Des études in vitro ont mis en évidence les rôles importants d’enzymes E2 lors de la neurogénèse : UBE2H favorise la prolifération des CSN tout en empêchant la différenciation neuronale, tandis qu’UBE2A modifie la différenciation des CSN par une augmentation de la taille des neurites.Les recherches restent donc encouragées par ces premiers résultats très prometteurs. / Autism is a neurodevelopmental disorder involving genetic factors. We use a candidate genes strategy selected for their key role in the ubiquitin pathway involved in mechanisms of neurogenesis and synaptic plasticity implicated in autism.Identification of the 37 human ubiquitin conjugating enzymes E2, grouped into 17 families, helped to select 6 enzymes to conduct a mutation screening in 195 autistic patients: UBE2H, UBE2A, UBE2K, UBE2I, UBE2N, UBE2E3.No mutation was detected in our autistic population, and no genetic evidence could involve UBE2K, UBE2A and UBE2N genes. However significant associations were identified with polymorphisms from UBE2E3, UBE2I and UBE2H genes.In vitro studies highlighted the important role of E2 enzymes during neurogenesis: UBE2H promotes the proliferation of NSC while preventing neuronal differentiation, while UBE2A alters differentiation of NSC by increasing the neurites size.Researches therefore remain encouraged by these very promising initial results.

L'ubiquitylation des protéines est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle capital dans la régulation des nombreuses fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire et la prolifération. Les dysfonctionnements de ce mécanisme sont à l'origine de diverses maladies telles que le cancer par exemple. Le processus d'ubiquitylation implique une série des réactions enzymatiques en cascade, catalysées par une famille des enzymes, structuralement très proches. Cette famille est composée des enzymes activateurs d'ubiquitine (E1s), des enzymes de conjugaison d'ubiquitine (E2s) et des ligases d'ubiquitine (E3s). Les interactions entre E2s et E3s sont dans le centre de la cascade d'ubiquitylation. Une combinaison particulière des pairs E2/E3 va déterminer le type de chaînes d'ubiquitine qui seront attachées à la protéine d'intérêt pour ensuite déterminer la fonction régulatrice de la voie d'ubiquitylation. A ce jour, seulement une petite fraction de paires possibles entre E2 et E3 a été investiguée par des approches biochimiques et in vitro. Cependant ces approches ne reflètent pas forcément des conditions qu'on trouve dans une cellule vivante. Prenant ceci en considération, les principales objectives de ma thèse seront comme suit : identifier et optimiser une méthode de détection et de quantification des interactions E2/E3 dans une cellule vivante de la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) ; construire une bibliothèque de souches de la levure qui permettrait d'établir des interactions entre E2 et E3 ; chercher de nouvelles potentielles paires E2/E3 ; caractériser fonctionnellement une potentielle paire E2/E2. Il est difficile de trouver une méthodologie appropriée afin d'étudier les interactions entre E2 et E3 parce qu'ils sont relativement faibles et transitoires. Leurs études nécessitent donc des techniques de détection avec une grande sensibilité. Parmi différentes techniques nous avons testé et choisi la complémentation bimoléculaire de la fluorescence, BiFC. Kurtosis, une mesure permettant localiser et quantifier la fluorescence BiFC-spécifique. Nos résultats nous nous avons permis à identifier 117 putatives paires E2/E3 parmi quels, 23 paires ont été déjà décrit dans la littérature. Parmi 94 nouvelles paires, certains E3s interagissent avec seulement une seule E2 ou d'autres donnent un signal BiFC avec plusieurs E2s. Ubc13, Ubc1 et Ubc4 sont les E2s qui interagissent le plus souvent. Nous avons identifié aussi une interaction entre les protéines Asi1 et Asi3 et les enzymes de conjugaison d'ubiquitine Ubc6 et Ubc7. Asi1 et 3 sont connus de former un complexe Asi1/3 sur la membrane intérieure du noyau impliqué dans la réponse de la cellule aux acides aminés extracellulaires. Ces protéines contiennent un domaine RING caractéristique pour les ligases d'ubiquitine mais cette activité n'était pas démontrée auparavant. / Protein ubiquitylation is a post-translational modification that plays a crucial role in regulating many cellular functions, including cell growth and proliferation. Defects in this control mechanism cause cancer and other diseases. The ubiquitylation process involves a cascade of enzymatic reactions catalyzed by a family of structurally-related enzymes, namely ubiquitin activating enzymes (E1s), ubiquitin conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin ligases (E3s). Interactions between E2s and E3s are in the centre of ubiquitylation cascade and it is a combination of particular E2/E3 pairs that determine what types of ubiquitin chains are made, thus determining the regulatory functions of the ubiquitin pathway. To date, only a small fraction of all possible E2/E3 pairs have been investigated, mainly using biochemical and in vitro approaches that may not accurately reflect the conditions that occur in living cells. We aimed to develop a method capable of detecting specific E2-E3 interactions under physiological conditions. Using budding yeast as a model organism, we found that the Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) enables sensitive detection of the well described Ubc4-Ufd4 pair under endogenous conditions. The assay is specific since the interaction signal is lost in yeasts expressing Ubc4 mutants truncated in its E3 interaction domain. We then used this system to further analyze the physiological network of E2 and E3 enzymes in living yeast. We performed a microscopy screen to assay all interactions between eleven E2s and 56 E3s. Our results show that approximately 20% of all E2/E3 combinations give a detectable BiFC signal. Few E3s interacted only with a single E2, whereas most E3s produced a BiFC signal with multiple E2s. Ubc13, Ubc1 and Ubc4 were found to be the most frequently interacting E2s. Our results match many examples from current literature but we also detected 94 new E2/E3 interactions, in particular we identified an interaction between the proteins Asi1 and Asi3 and E2s Ubc6 and Ubc7. Asi1 and Asi3 are known to form a complex (the Asi1/3 complex) at the inner nuclear membrane and are involved in the regulation of the response to extracellular amino acids. The Asi1/3 complex was suspected to function as a ubiquitin ligases because they contain a RING domain, but this has previously not been demonstrated. We therefore further characterized them functionally.