Les maladies lysosomales forment un groupe hétérogène d’une cinquantaine d’affections qualifiées de « rares ». Actuellement, seulement 9 maladies lysosomales disposent d’un traitement spécifique, principalement par enzymothérapie substitutive, mais les effets bénéfiques sont souvent limités. Le manque de ciblage pour le Récepteur du Mannose 6-Phosphate (RM6P), responsable de l’internalisation dans les lysosomes, expliquerait en partie cette efficacité modérée des enzymes thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons développé une approche de ciblage innovante basée sur des Analogues synthétiques du Mannose 6-Phosphate fonctionnalisés sur l’Aglycone (appelés AMFA) afin de répondre aux besoins non satisfaits par les traitements actuels.Les travaux de cette thèse portent principalement sur la maladie de Pompe, myopathie causée par la déficience d’une enzyme lysosomale, l’Alpha Glucosidase Acide (GAA), responsable de la conversion du glycogène en glucose. Afin d’améliorer l’adressage de l’enzyme thérapeutique aux lysosomes via le RM6P, nous avons fonctionnalisé la GAA recombinante humaine (rhGAA) avec les AMFA. Nos études sur la forme adulte de la maladie ont démontré une augmentation significative de l’internalisation et pour la première fois, chez des souris âgées modèles de la maladie, une restauration de la santé musculaire et une amélioration significative de la fonction motrice ont été observées (article 1). Nous nous sommes ensuite intéressés aux propriétés de la rhGAA-AMFA. Nous avons démontré que l’efficacité de la rhGAA-AMFA n’était pas uniquement due à une meilleure internalisation mais également à une meilleure maturation intracellulaire de l’enzyme (article 2). En effet, nos résultats ont démontré que chez les patients atteints de la maladie de Pompe, il existe une surexpression des phosphatases acides ACP2 et ACP5. Ces phosphatases peuvent détruire le signal mannose 6-phosphate (M6P) naturellement présent sur l’enzyme, ce qui interrompt sa maturation en forme active. L’AMFA, contrairement au M6P, est insensible à cette dégradation et assure donc la stabilité de l’adressage de l’enzyme in vitro, mais également in vivo.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le greffage des AMFA sur des enzymes recombinantes représente une nouvelle solution thérapeutique pour le traitement de la maladie de Pompe et potentiellement pour le traitement d’autres maladies lysosomales. / Lysosomal diseases form a heterogeneous group of about fifty rare diseases. At present, only 9 lysosomal diseases have a specific treatment, mainly by enzyme replacement therapy but the beneficial effects appear often limited. The lack of targeting for the Mannose 6-Phosphate Receptor (M6PR), responsible for internalization into the lysosomes, would partly explain this moderate efficiency of the therapeutic enzymes. In this context, we have developed an innovative targeting approach based on Mannose 6-Phosphate Synthetic Analogues Functionalized at the Aglycone position (called AMFAs) to address the unmet needs of current treatments.The work of this thesis focuses mainly on Pompe disease which is a myopathy caused by the deficiency of a lysosomal enzyme, Acid Alpha Glucosidase (GAA), responsible for the conversion of glycogen into glucose. In order to improve the targeting of the therapeutic enzyme to lysosomes via the M6PR, we have functionalized the human recombinant GAA (rhGAA) with the AMFAs. Our studies on aged mice model of the adult form of the disease have demonstrated a significant increase of the enzyme internalization and for the first time, the restoration of muscle health and the significant improvement in motor function (article 1). We then investigated the properties of rhGAA-AMFA. We have proved that the effectiveness of rhGAA-AMFA is not only due to a better cell uptake but also to a more complete intracellular processing of the enzyme (article 2). Indeed, our results demonstrated that in myoblasts of patients affected by Pompe disease there is an overexpression of ACP2 and ACP5 acid phosphatases. These phosphatases can destroy the mannose 6-phosphate signal (M6P) naturally present on the enzyme, therefore possibly interrupting its processing into the active form. AMFA, unlike M6P, is insensitive to this degradation and thus ensures the stability of enzyme addressing in vitro, but also in vivo.All together, these results suggest that the grafting of the AMFAs on recombinant enzymes represents a new therapeutic solution for the treatment of Pompe disease and potentially for other lysosomal diseases.

Sur la cinquantaine de maladies rares lysosomales, seules 8 peuvent être traitées par enzymothérapie substitutive avec plus ou moins d’efficacité. Il y a donc un réel besoin de développer de nouveaux traitements mais aussi de mieux caractériser les causes de ces maladies. Durant cette thèse nous nous sommes intéressés à la maladie de Pompe qui résulte de l’absence ou de la carence en enzyme lysosomale alpha-glucosidase acide (GAA) responsable de la dégradation du glycogène en glucose dans de nombreux tissus. Actuellement seule la forme infantile de cette maladie peut être traitée alors que la forme juvénile/adulte est faiblement améliorée par le traitement Myozyme®. Cette thèse a eu pour but de développer une nouvelle enzymothérapie qui, à terme, permettrait d’empêcher la progression de la maladie et de soigner, de manière satisfaisante, les formes juvéniles et adultes de la maladie de Pompe. Dans ce but, nous avons utilisé des dérivés monosaccharidiques « Analogues du Mannose-6-phosphate (M6P) Fonctionnalisés sur l’Aglycone (AMFA) », qui sont ensuite greffés sur la GAA recombinante humaine (rhGAA) afin d’améliorer son adressage aux lysosomes obtenant la rhGAA-AMFA.Une première étude in vitro, sur des fibroblastes de patients atteints de la forme adulte de la maladie, a démontré que le greffage des AMFA sur la rhGAA produite en cellules d’insectes Sf9 améliorait significativement l’affinité pour le récepteur du M6P (RM6P), l’internalisation et l’activité de l’enzyme et lui conférait une efficacité sur les souris GAA-/-, modèles de la maladie de Pompe, par rapport au traitement actuel (Article 1). Puis nous avons pu démontrer, pour la première fois, l’efficacité de la rhGAA-AMFA produite en cellules CHO sur des souris GAA-/- âgées. Ces résultats suggèrent, ainsi, la possibilité d’utiliser cette néo-enzyme dans le traitement de la forme adulte de la maladie (Article2). Enfin, le greffage des AMFA permet d’obtenir une maturation intracellulaire complète de la rhGAA sous forme active dans des myoblastes et myotubes de patients adultes et dans les quadriceps de souris âgées modèles Pompe, ce qui n’a pas été observé pour Myozyme® (Article 3). Lors de cette thèse, nous avons également démontré que de nouveaux analogues disaccharidiques, ayant une meilleure affinité que les monosaccharides pour le RM6P, peuvent efficacement cibler la rhGAA pour le traitement de la maladie de Pompe. Un brevet a été déposé sur ces résultats (Brevet PCT/FR2016/052339).En conclusion, ce travail a permis de développer une nouvelle technologie de ciblage plus efficace des enzymes lysosomales par des analogues synthétiques. La désignation de médicament orphelin pour l’alpha glucosidase acide conjuguée aux analogues du mannose-6-phosphate a été obtenue suite à ces travaux auprès de l’Agence Européenne du Médicament pour le traitement de la maladie de Pompe (EMA/OD/098/16).Mots clés: maladies lysosomales, maladie de Pompe, enzymothérapie, récepteur du mannose 6-phosphate / On 53 known rare lysosomal diseases, only 8 can be treated by enzyme replacement therapy with more or less efficiency. There is therefore a need to develop new treatments but also to better characterize these diseases. During this thesis, we focused on Pompe disease which results from the absence or deficiency of the lysosomal enzyme alpha-glucosidase acid (GAA), responsible for the degradation of glycogen in glucose in many tissues. Currently only the infantile form of this disease can be treated while the juvenile/adult form is slightly improved by Myozyme® treatment. This thesis aimed to devel a new enzyme replacement therapy which could prevent the progression of the disease and satisfactorily treat the late onset form of the disease. To do that, we used monosaccharide derivatives “Mannose-6-phosphate analogues (M6P) Functionalized on Aglycone (AMFA)”, which were grafted onto human recombinant GAA (rhGAA) in order to improve its lysosome addressing obtaining the rhGAA-AMFA.A first in vitro study on adult patient fibroblasts showed that the addition of AMFA to rhGAA, produced in Sf9 insect cells, significantly improved its affinity for the M6P receptor (RM6P), its internalization and activity. It was also more efficient on the GAA-/- Pompe mouse model compared to current treatment (Article 1). Then, we demonstrated for the first time the efficiency of rhGAA-AMFA produced in CHO cells in aged mice model. These results suggest the possibility to use this neo-enzyme in the treatment of the adult form that still resists to treatment (Article 2). Finally, the addition of AMFA allows a complete maturation of rhGAA into its active form in myoblasts and myotubes of adult patients and in the quadriceps of aged mice Pompe model. This was not observed for Myozyme® (Article 3). In this thesis we have also demonstrated that novel disaccharide analogues with a better affinity than monosaccharides for RM6P can efficiently target GAA for the treatment of Pompe disease. A patent has been filed on these results (Patent PCT / FR2016 / 052339).In conclusion, this work has led to the development of a new technology more efficient in targeting lysosomal enzymes by mean of new synthetic analogues. An orphan drug designation for the recombinant human acid alpha-glucosidase conjugated with mannose-6-phosphate analogues was obtained on the basis of this work at the European Medicines Agency for the treatment of Pompe disease (EMA/OD/098/16).Key words: lysosomal diseases, Pompe disease, enzyme replacement therapy, mannose 6-phosphate receptor