A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

Orientador: Lucilene Silva Ruiz e Resende / Resumo: Pesquisaram-se 28 antígenos eritrocitários pertencentes aos sistemas de grupos sanguíneos humanos ABO, H, Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran e Diego, nos eritrócitos de 9 macacos-prego (Sapajus sp) e 10 macacos bugios (Alouatta sp).A maioria dos antígenos humanos pesquisados não foi observada nos 2gêneros de macacos, correspondendo a 19/28 antígenos negativosnos Sapajus sp, e 20/28 antígenos negativosnos Alouatta sp. A fenotipagem eritrocitária foi bastante semelhante em cada grupo de animais, sendo que 5 macacos-prego diferiram dos outros 4 apenasno sistema ABO, e 3 macacos bugios diferiram dos demais 7somente no sistema MNS.Houve diferenças antigênicasentre os gênerosem apenas4 sistemas de grupos pesquisados (P, ABO, Rh, MNS). Constataram-se, nos animais, alguns antígenos eritrocitários com frequências semelhantes e outros com frequências opostas às observadas em humanos ou etnias humanas. Em comparação comestudos prévios envolvendo macacos-prego e macacos bugios, observou-se concordância quanto à presença ou ausência de alguns antígenos eritrocitários, e discordância em relação a outros.Que seja do nosso conhecimento, o presente estudo é o mais completo já realizado quanto ao número de antígenos eritrocitários pesquisados em macacos do Novo Mundo, especialmenteem macacos brasileiros. / Mestre

Submitted by Adaize Pereira da Silva null (adaizebtu@yahoo.com.br) on 2017-07-27T13:16:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Adaize Pereira da Silva 2017.pdf: 4597216 bytes, checksum: 9b1d24ba6fa08e7d6ad4c1c97960e1e8 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-31T18:44:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_ap_me_bot.pdf: 4597216 bytes, checksum: 9b1d24ba6fa08e7d6ad4c1c97960e1e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T18:44:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_ap_me_bot.pdf: 4597216 bytes, checksum: 9b1d24ba6fa08e7d6ad4c1c97960e1e8 (MD5) Previous issue date: 2017-06-29 / Pesquisaram-se 28 antígenos eritrocitários pertencentes aos sistemas de grupos sanguíneos humanos ABO, H, Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran e Diego, nos eritrócitos de 9 macacos-prego (Sapajus sp) e 10 macacos bugios (Alouatta sp).A maioria dos antígenos humanos pesquisados não foi observada nos 2gêneros de macacos, correspondendo a 19/28 antígenos negativosnos Sapajus sp, e 20/28 antígenos negativosnos Alouatta sp. A fenotipagem eritrocitária foi bastante semelhante em cada grupo de animais, sendo que 5 macacos-prego diferiram dos outros 4 apenasno sistema ABO, e 3 macacos bugios diferiram dos demais 7somente no sistema MNS.Houve diferenças antigênicasentre os gênerosem apenas4 sistemas de grupos pesquisados (P, ABO, Rh, MNS). Constataram-se, nos animais, alguns antígenos eritrocitários com frequências semelhantes e outros com frequências opostas às observadas em humanos ou etnias humanas. Em comparação comestudos prévios envolvendo macacos-prego e macacos bugios, observou-se concordância quanto à presença ou ausência de alguns antígenos eritrocitários, e discordância em relação a outros.Que seja do nosso conhecimento, o presente estudo é o mais completo já realizado quanto ao número de antígenos eritrocitários pesquisados em macacos do Novo Mundo, especialmenteem macacos brasileiros. / The aim of this study was to evaluate the presence of 28 erythrocyte antigens of 11 human blood groups systems (ABO, H, Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Lutheran and Diego) on erythrocytes of 9 nail monkeys (Sapajus sp) and 10 howler monkeys (Alouatta sp). Most of the human erythrocyte antigens were not observed in the 2 generaof monkeys, corresponding to 19/28 negative antigens in Sapajus sp, and 20/28 negative antigens in Alouatta sp. Erythrocyte phenotyping was very similar in each group, being that 5 nail monkeys differed from the other 4 only for the ABO system, and 3 howler monkeys differed from the other 7 only for the MNS system.Antigenic differences between the 2 generawere observed only for 4 blood groups systems (P, ABO, Rh, MNS). This study revealed that some monkey erythrocyte antigens were similar in frequency, and others werein opposite frequency from those observed in human or human ethnicities.When this study is compared with previous similar studies some concordance and some disagreement of findings are found, but as far as we known our study is the most complete in relation to the number of investigated erythrocyte antigens in New World monkeys, specially in the Brazilian ones.

La médecine transfusionnelle féline a connu une croissance exponentielle au cours des dix dernières années. La découverte du système de groupes sanguins AB et la meilleure compréhension des mécanismes d’incompatibilité donneur-receveur, ainsi que le développement de systèmes de collecte adaptés au chat et de techniques de typage sanguin au chevet du patient ont permis d’améliorer la sécurité des transfusions. Notre travail s’est intégré dans cette volonté d’optimiser la sécurité des transfusions sanguines chez le chat en se concentrant sur deux aspects différents : le prélèvement de sang et les antigènes érythrocytaires à l’origine d’incompatibilités donneur-receveur non expliquées par le système AB. Dans un premier temps, un système de collecte de sang adapté au chat a été fabriqué afin de permettre un prélèvement fermé et autoriser le stockage des produits sanguins. Ce système a été comparé à un système ouvert composé de seringues. Le système fermé apparaît adapté au prélèvement de sang car aucune différence significative n’a été enregistrée dans les paramètres vitaux des donneurs après le prélèvement, le succès du prélèvement, ou la qualité du produit sanguin en termes de contamination bactérienne et d’hémolyse, entre les deux systèmes. Le net avantage du système fermé est qu’il assure un temps de prélèvement plus rapide que le système ouvert. Dans un second temps, en réalisant des tests de compatibilité chez 258 chats de type A, nous avons montré que la probabilité de détecter des incompatibilités entre deux chats de groupe A sélectionnés aléatoirement était de 3.9 %, et que 7 % des chats de groupe A présentaient des allo-anticorps naturels extérieurs au système AB. Sept des 18 allo-anticorps naturels détectés ont été utilisés comme réactifs lors d’un typage sanguin extensif. Les analyses sur l’accord des résultats du typage obtenus avec les différents réactifs ont permis d’identifier cinq nouveaux antigènes érythrocytaires félins différents, nommés FEA 1 à FEA 5 (pour feline erythrocyte antigen), dont l’hérédité, la prévalence, la distribution géographique et par race, ainsi que l’immunogénicité restent encore à déterminer. / Feline transfusion medicine has grown exponentially over the past decade. The discovery of the AB blood group system and the better understanding of the mechanisms of donor-receiver incompatibility, as well as the development of cat-friendly collection systems and bedside blood typing techniques have improved transfusion safety. Our work has been part of this effort to optimize the safety of blood transfusions in cats by focusing on two different aspects: blood collection and red blood cell antigens that cause donor-recipient incompatibilities unexplained by the AB system. First, a blood collection system adapted to the cat was manufactured to allow collection in a closed-system and storage of blood products. This system was compared to an open system consisting of syringes. The closed system appeared well-adapted for feline blood collection because no significant difference was found in the vital parameters of the donors after collection, the success of the collection, or the quality of the blood product in terms of bacterial contamination and hemolysis. The distinct advantage of the closed system was that it provided a shorter duration of collection than the open system. Secondly, based on the systematic crossmatches of 258 cats, we showed that the probability of detecting incompatibilities by randomly crossmatching two type A cats was 3.9 %, which resulted in at least 7 % of type A cats having naturally occurring alloantibodies outside the AB blood group system. Seven of the 18 detected naturally occurring alloantibodies were used as reagents in an extensive blood typing. Comparison of the results obtained from this extensive blood typing supports the existence of five, presumably different, new feline erythrocyte antigens, named FEA 1 to FEA 5, whose mode of inheritance, geographical and breed distribution, frequency and immunogenicity have yet to be determined.