Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Flavio Marques Lopes.pdf: 1637206 bytes, checksum: 95899c1fbc6b76141c229cf07f0d9d1b (MD5) Previous issue date: 2008-10-23 / In this research, open ground samples (Brazilian Savannah Cerrado) proceeding from treated cultures of soy with Opera® (epoxiconazol and piraclostrobin) had been used as source of resistant microorganisms to fungicide. The sample were collected in July 2006, in three points of planted area and two depths, 0 to 20 cm, and from 80 cm to 1m, next to the state highway GO-139, in the towns of São Miguel do Passa Quatro, in a producing farm model of soy seeds, where Opera® was used since its launching in 2002. The collection point was characterized as a risk place for ecological accidents, presenting area with extensive agriculture activity, intense use of pest management, soil with good level of infiltration and storage of water, and areas of declivity. The microorganism s selection was carried through using selective solid J.E. supplemented with 0.1% of Opera® with microorganisms collected in depth of 80cm. In a previous selection, 9 microorganisms were isolated, and from these, the one that showed a better growth within the selective J.E. liquid supplemented with 0.03% of Opera® (1805) was chosen for the development of this research. The analysis for coloration of Gram-negative showed that the isolated microorganism is one bacillococcus Gram-negative with poliphormic characteristics, being sensible to all the tested antibiotics. Biochemical identification made through the method of Bactray®, presented a correlaction of 99% with the genus Klebsiella. Through molecular identification by the gene 16S rDNA, it was possible to find a correlaction of 99% of similarity with the species K.pneumoniae and K. oxytoca. The proteins released by the Klebsiella in a supplemented environment with 0.03% of Opera had been precipitated with acetone, obtaining two proteinic fractions, a soluble (FS) and the other insoluble (FI) in a 0,1 mol L-1 phosphate buffer, pH 6.0. In the soluble solution (FS), it was found an oxirredutase from the peroxidases family, which uses hydrogen peroxide as an agent and several substrates as reducing agents, presenting greater activity for pyrogallol, TMB, o-dianisidine and catechol. In a chromatogram obtained through separation by molecular exclusion in Sephadex G- 100, two peaks with peroxidasic activities had been observed. Peak 1 presented two bands in SDS-PAGE, one with39.3 kDa and another one with 24.6 kDa. In the FI, it was possible to determine the presence of one hydrolysis with capacity to break the bonds between the ester molecule, from the family of carboxylesterases esterase B. The esterase B presented activity against casein substrates (9.3 UE), BApNA (1.31 UE), pNPP (0.01), presenting 5,4% activity of inhibition after incubation with E64, 6.5% activity of inhibition after incubation with protease inhibitors cocktail containing AEBSF and 7.5% of inhibition after incubation with TLCK. The electrophoreses of FI presented two protein bands with molecular mass of approximately 61.7 kDa for superior band and 60.7 kDa for the inferior band. The enzymatic characterization using pNPP showed high activity in pH 5.0 and pH 7.0. Esterase B kept 100% of activity after 120 minutes of incubation at 60oC. The presence of ZnCl2, EDTA, MgSO4 and CuSO4 had presented an inhibition effect of 16%, 16%, 23.2% and 40.8% respectively, within the enzyme activity. Esterase B slightly presented higher activity in the presence of DMSO and acetone, and a reduction of up to 87% comparing to isopropyl alcohol (lower polarity). The vale of Km using pNPP as substratum was of 3.4 mmol L-1, with a Vmax of 0.019 UE. When the selective J.E. supplemented with 0.03% Opera was treated with Klebsiella for 120 h, it had a reduction of 43.7% in the absorbance of the compounds with a peak of 200 nm, 55.7% - 220 nm and 28.7% - 260 nm. Using released enzymes by Klebsiella for treatment of the epoxiconazol standards in the reduction of the absorbance 200, 220 and 260 nm the observed results were 99.7%, 95.7% and 99.5% respectively. Whereas for the pyraclostrobin, the observed reduction were 95.5% and 80.2% for the wave lengths 200 and 260 nm respectively / Neste trabalho amostras de solo de cerrado provenientes de culturas de soja tratadas com Opera® (epoxiconazol e piraclostrobin) foram utilizadas como fonte de microrganismos resistentes ao fungicida. A coleta foi realizada no mês de julho de 2006, em três pontos de área plantada e em duas profundidades, 0 a 20 cm e de 80 cm a 1 m, próximo à rodovia estadual GO-139, no município de São Miguel do Passa Quatro, em uma fazenda modelo produtora de sementes, em que o Opera® foi utilizado desde o seu lançamento em 2002. O ponto de coleta foi caracterizado como um local de risco a acidentes ecológicos, apresentando área com atividade agrícola extensiva, uso intenso de defensivos agrícolas, solos com boa taxa de infiltração e armazenamento de água e áreas de declividade. A seleção dos microrganismos foi feita com meio seletivo J. E. sólido - suplementado com 0,1% de Opera®, com microrganismos coletados na profundidade de 80 cm. Na primeira etapa 9 microrganismos foram isolados e, destes, o microrganismo 1805 foi o que apresentou melhor crescimento em meio seletivo J. E. líquido - suplementado com 0,03% de Opera® sendo escolhido para o desenvolvimento deste trabalho. A análise por coloração de Gram mostrou que o microrganismo isolado é um bacilococco Gram-negativo com características polimórficas, sendo sensível a todos os antibióticos testados. A identificação bioquímica pelo método de Bactray® apresentou correlação a nível de 99% com o gênero Klebsiella. Através de identificação molecular pelo gene 16S rDNA foi possível encontrar uma correlação de 99% de similaridade com as espécies K. pneumoniae e K. oxytoca. As proteínas secretadas pela Klebsiella em meio suplementado com 0,03% de Opera® foram precipitadas com acetona, obtendo duas frações protéicas, uma solúvel (FS) e outra insolúvel (FI) em tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,0. Na FS foi encontrada uma oxirredutase da família das peroxidases, que utiliza o peróxido de hidrogênio como agente oxidante e vários substratos como agentes redutores, apresentando maior atividade para pirogalol, TMB, o- ianizidina e catecol. No cromatograma obtido na separação por exclusão molecular em Sephadex G-100 foram observados dois picos com atividade peroxidásica. O pico 1 apresentou duas bandas em SDS-PAGE, uma mais forte com 39,3 kDa e outra com 24,6 kDa. Na FI foi possível determinar a presença de uma hidrolase, com capacidade de degradação de ligações éster, da família das carboxilesterases esterase B. A esterase B apresentou atividade contra os substratos caseína (9,3 UE), BApNA (1,31 UE), pNPP (0,01 UE), apresentando 5,4% de inibição com E64, 6,5% de inibição após incubação com coquetel de inibidores contendo AEBSF e 7,5% de inibição após incubação com TLCK. A eletroforese da FI apresentou duas bandas de proteínas com massa molecular de aproximadamente 61,7 kDa para a banda superior e 60,7 kDa para a banda inferior. A caracterização enzimática utilizando pNPP mostrou atividade alta em pH 5,0 e em pH 7,0. A esterase B manteve 100% de atividade após 120 minutos de incubação a 60 ºC. A presença de ZnCl2 aumentou a atividade em 14,2%, FeCl3 e MnSO4 não tiveram efeito significativo sobre a atividade e os demais sais, CaCl2, EDTA, MgSO4 e CuSO4 apresentaram um efeito inibitório de 16%, 16%, 23,2% e 40,8% respectivamente, na atividade da enzima. A esterase B apresentou atividade ligeiramente mais alta na presença de DMSO e acetona, e uma redução de até 87% frente ao isopropanol (solvente com menor polaridade). O valor de Km encontrado utilizando pNPP como substrato foi de 3,4 mmol L-1, com uma Vmáx de 0,019 UE. Quando o meio seletivo J. E. suplementado com 0,03% de Opera foi tratado com a Klebsiella por 120 h, houve uma diminuição 43,7% na absorvância dos compostos com pico a 200 nm, 55,7% a 220 nm e 28,7% a 260 nm. Usando as enzimas secretadas pela Klebsiella para tratamento do padrão epoxiconazol a redução da absorvância observada em 200, 220 e 260 nm foi de 99,7%, 95,7% e 99,5% respectivamente. Para o piraclostrobin a redução observada foi de 95,5 e 80,2% nos comprimentos de onda 200 e 260 nm respectivamente