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Separação e purificação de α-lactoalbumina e β-lactoglobulina pela cromatografia por exclusão molecular após a extração com sistemas aquosos bifásicos / Separation and purification of α-lactalbumin and β-lactoglobulin using size exclusion chromatography after aqueous two-phase systems extraction

Rojas, Edwin Elard Garcia 02 August 2001 (has links)
Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-17T14:36:25Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 554608 bytes, checksum: 6313f872248e8f64eb7415715940cb97 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-17T14:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 554608 bytes, checksum: 6313f872248e8f64eb7415715940cb97 (MD5) Previous issue date: 2001-08-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho, foi utilizada a cromatografia por exclusão molecular (CEM) para purificação das proteínas do soro de queijo α-lactoalbumina (α-la) e β-lactoglobulina (β-lg) presentes, respectivamente, nas fases polimérica e salina de sistemas aquosos bifásicos (SAB), compostos por polietilenoglicol (PEG), água e fosfato de potássio (FFP). As viscosidades das fases foram o parâmetro empregado para selecionar a concentração de soro de queijo a ser adicionada aos SAB. Usando os dados de viscosidade, foi escolhido para estudo o SAB composto por 18% PEG 1500 + 18% FFP + 10% de soro de queijo + 54% água, (%peso/peso). Partindo deste sistema, foram determinadas as melhores condições operacionais para a CEM: 4,0 mL/min de vazão e 0,5 mL de volume de amostra para a fase polimérica e 2,0 mL/min de vazão e 0,5 mL de volume de amostra para a fase salina. Nestas condições, a resolução, a produtividade e o grau de purificação foram, respetivamente, de 1,53, 0,43 mg.(mL.h) -1 e 99,7% para a fase salina e de 1,29, 0,31 mg.(mL.h) -1 e 99,6% para a fase polimérica. A resina que melhor se adequou ao processo de separação foi a Shepadex G-25® médio (50-150) μm. Na modelagem do processo cromatográfico, foi empregado um modelo matemático cosiderando dispersão axial na coluna e difusão radial em cada partícula. Foram calculados os parâmetros de transferência de massa por meio de regressão não linear, utilizando o método de programação quadrática sucessiva. A modelagem levou a resultados satisfatórios descrevendo, adequadamente, o processo cromatográfico de exclusão molecular. / Size exclusion chromatography (SEC) was used in this work to purify the cheese whey proteins α-lactalbumin (α-la) and β-lactoglobulin (β-lg) present, respectively, in the polymeric and saline phases of aqueous two phase systems (ATPS), composed by polyethyleneglycol (PEG), water and potassium phosphate (FFP). The phase viscosities where the parameters applied to choose whey proteins concentration to be added into the ATPS. It was selected the ATPS formed by 18% (w/w) PEG 1500 + 18% (w/w) FFP + 10% (w/w) of cheese whey + 54% water. Based on this system, the best operational conditions for SEC were 4,0 mL/min of flow rate and 0,5 mL of sample volume for the polymeric phase and 2,0 mL/min of flow rate and 0,5 mL of sample volume for the saline phase. Under these conditions, resolution, productivity and purification degree were, respectively, of 1.53, 0.43 mg.(mL.h) -1 and 99.7% for the saline phase and 1.29, 0.31 mg.(mL.h) -1 and 99.6% for the polymeric phase. The resin that best fit the purification process was ShepadexG-25® medium (50-150 μm). A mathematical model with axial dispersion in the column and radial diffusion in each particle was used to model the chromatographic process. Mass transfer parameters were calculated by means of non-linear regression, using the successive quadratic programming method. The process was successful describe by the model
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Validação de método cromatográfico por exclusão molecular para avaliação de interferon-alfa2a e estudos de correlação / Validation of a size-exclusion LC method for the evaluation of rhIFN-α2a and correlation estudies

Zimmermann, Estevan Sonego 30 September 2010 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Human interferon-α2a (hIFN-α2a) is a natural protein produced by the cells of the immune system with antiviral, antiproliferative and immunomodulatory properties. A size exclusion liquid chromatography (SE-LC) method was validated for the determination of recombinant interferon-α2a (rhIFN-α2a) in pharmaceutical formulations without human serum albumin. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.) maintained at 25°C. The mobile phase consisted of 0.001 M monobasic potassium phosphate, 0.008 M sodium phosphate dibasic and 0.2 M sodium chloride buffer, pH 7.4, run at a gradiente flow rate and using photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The chromatographic separation was achieved with retention time of 17.2 min, and was linear over the concentration range of 0.5-50 MUI/mL (r2 = 0.9996). The accuracy was 101.39% with bias lower than 1.67%. The limits of detection and quantitation were 0.22 and 0.5 MIU/mL, respectively, and the method validation demonstrated acceptable results for precision and robustness. The proposed method was applied for the analysis of rhIFN-α2a in pharmaceutical dosage forms, and the content/potencies correlated to the previously validated reversed-phase (RP-LC), and the in vitro bioassay. The pharmaceutical samples were analyzed by the chromatographic methods and compared to the bioassay, showing mean differences between the estimated potency of 1.50% higher for SE-LC, and 2.45% lower for the RP-LC. The alternative methods studies contribute to improve the quality control, assuring the therapeutic efficacy of the biological medicine. Moreover, the pharmacokinetic parameters of the formulations A and B were evaluated by subcutaneous injection in rats, showing comparable profiles with Cmax of 7924.60 and 8698.68 pg/mL, respectively, and Tmax= 60 min. / O interferon-α2a humano (hIFN-α2a) é uma proteína produzida pelas células do sistema imune com propriedades imunomoduladora, antiviral e antiproliferativa. No presente trabalho, foi validado método por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM), para determinação de interferon-α2a recombinante (rhIFN-α2a) em formulações farmacêuticas sem albumina. O método CL-EM foi validado empregando coluna BioSep-SEC-2000 S (300 mm x 7,8 mm d.i.) mantida a temperatura de 25°C. A fase móvel foi composta de tampão fosfato de potássio monobásico 0,001 M, fosfato de sódio dibásico 0,008 M e cloreto de sódio 0,2 M, pH 7,4, eluída em gradiente de fluxo e utilizando arranjo de diodos (DAD) com detecção em 214 nm. A separação cromatográfica foi alcançada com o tempo de retenção de 17,2 min e o método foi linear no intervalo de concentração de 0,5-50 MUI/mL (r2 = 0,9996). A exatidão média foi de 101,39%, com erro calculado inferior a 1,67%. Os limites de detecção e quantificação foram de 0,22 e 0,5 MUI/mL, respectivamente e a validação demonstrou parâmetros aceitáveis de precisão e robustez. O método proposto foi aplicado para análise de formulação farmacêutica de rhINF-α2a e os teores/potências correlacionados com aqueles fornecidos pelos métodos previamente validados por CL-FR e bioensaio in vitro. Estabeleceu-se correlação entre os métodos, demonstrando que os biofármacos comerciais apresentaram diferenças entre as médias 1,5% maiores para o CL-EM, e 2,45% menores para CL-FR, em relação ao bioensaio. Assim, contribuiu-se para estabelecer alternativas que aprimoram o controle de qualidade, assegurando a eficácia terapêutica do produto biológico. Além disso, avaliaram-se os parâmetros farmacocinéticos das formulações A e B após injeção subcutânea em ratos, demonstrando perfis comparáveis com Cmax de 7924,60 e 8698,68 pg/mL, respectivamente, e Tmax= 60 min.
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DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA AVALIAÇÃO DE INTERFERON-ALFA 2a EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS / DEVELOPMENT AND VALIDATION OF CHROMATOGRAPHIC METHODS FOR THE EVALUATION OF INTERFERON-ALFA 2a IN PHARMACEUTICAL FORMULATIONS

Silva, Lucélia Magalhães da 17 March 2009 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The interferon is a cytokine with antiviral, antiproliferative, and immunomodulatory properties. It is a protein synthesized by cells in response to viral infection, producing successive biochemistry alterations. The chromatographic methods for evaluation of recombinant interferon-alfa 2a (rhIFN-α2a) in pharmaceutical products were validated in the present work. The reversed-phase liquid chromatography method (RP-LC) was developed and validated using a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase A consisted of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and mobile phase B consisted of 0.1% TFA in acetonitrile, run in gradient: 0.01 1 min, 38% of B; 1 5 min, 38 43% of B; 5.01 20 min, 43 45% of B; 20.01 30 min, 45 48% of B; 30.01 40 min linear back to 38% of B and 40 42 min, 38% of B. The flow rate used was 1 mL/min with detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained within 42 min and it was linear in the concentration range of 0.5 50 MIU/mL (r2=0.9999). The size exclusion method was developed and validated using a BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase consisted of 1mM potassium phosphate monobasic, 8mM sodium phosphate dibasic and 200mM sodium chloride buffer, pH 7.4, run at a gradient flow rate: 0.01 20 min, 0.5 mL/min; 20 25 min, 0.5 1.7 mL/min; 25 35 min, 1.7 mL/min; 35 38 min, 1.7 0.5 mL/min; 38 40 min, 0.5 mL/min. The method was linear in the concentration range of 0.5 - 50 MIU/mL (r2=0.9996). The procedures were validated by the parameters of specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of quantitation and limit of detection. The methods were applied for the evaluation of the rhIFN-α2a in pharmaceutical products, contributing for the establishment of alternatives which improve the quality control, assuring the safety and therapeutic efficacy of the biological product. / O interferon é uma citocina que possui ação antiviral, imunomoduladora e antiproliferativa. É uma proteína sintetizada pelas células em resposta a infecção viral, gerando sucessivas alterações bioquímicas. No presente trabalho foram validados métodos cromatográficos para a avaliação de interferon-alfa 2a (rhIFN-α2a) em produtos farmacêuticos. O método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) foi desenvolvido e validado empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B de ácido trifluoracético 0,1% em acetonitrila, eluídas no gradiente: 0,01 1 min, 38% de B; 1 5 min, 38 43% de B; 5,01 20 min, 43 45% de B; 20,01 30 min, 45 48% de B; 30,01 40 min, 48 38% de B, mantendo-se nesta proporção até 42 min. Utilizou-se vazão de 1 mL/min e detecção no ultravioleta a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 42 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,5 - 50 MUI/mL (r2=0,9999). Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método cromatográfico por exclusão molecular (CL-EM) empregando coluna BioSep-SECS 2000 (300 mm x 7,8 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel foi composta de tampão fosfato de potássio monobásico 1mM, fosfato de sódio dibásico 8mM e cloreto de sódio 200mM, pH 7,4, eluída no gradiente de fluxo: 0,01 20 min, 0,5 mL/min; 20 25 min, 0,5 1,7 mL/min; 25 35 min, 1,7 mL/min; 35 38 min, 1,7 0,5 mL/min; 38 40 min, 0,5 mL/min. O método foi linear na faixa de concentração de 0,5 - 50 MUI/mL (r2=0,9996). Ambos os procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de quantificação e detecção. Os métodos foram aplicados para avaliação de rhIFN-α2a em produtos farmacêuticos, contribuindo para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.
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Avaliação da potência do hormônio da paratireóide humano recombinante por bioensaio, métodos cromatográficos e eletroforético / Recombinant human parathyroid hormone potency evaluation by bioassay, chromatographic and electrophoretic methods

Maldaner, Fernanda Pavani Stamm 24 May 2017 (has links)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / The human parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide secreted by the parathyroid glands that is essential for the maintenance of the calcium ion homeostasis in the blood. The recombinant DNA technology has enabled the expression of hPTH gene in Escherichia coli, and thus the large-scale production of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34), teriparatide, which contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH. The rhPTH is clinically used to treat osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women, men with osteoporosis primary or hypogonadal and adults with glucocorticoid-induced osteoporosis (GIO). Cappilary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated for the assessment of rhPTH in biopharmaceutical formulations. The analysis for CZE method was performed on a fused-silica capillary (effective length, 40 cm; 50 μm i.d.), using electrolyte solution consisted of 50 mM dihydrogen phosphate solution at pH 3.0. The capillary was maintained at 25º C, the applied voltage was 20 kV. Injections were performed using a pressure mode at 50 mbar for 45 s, with detection by photodiode array detector set at 200 nm. Separation was obtained with a migration time of 5.3 min, and was linear over the concentration range of 0.25-250 μg mL-1 (r2 = 0.9992). The limits of detection and quantitation were 0.12 and 0.40 μg/mL, respectively. Specificity and stability-indicating capability were established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. The accuracy was 100.28% with bias lower than 0.85%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of acidic, photolytic and thermal degradated forms showed significant differences (p<0.05) compared to intact molecule. The cell proliferation and alkaline phosphatase activity bioassays in UMR-106 cells were developed and applied to assess the biological activity of rhPTH in biopharmaceutical formulations The results of content/potency were correlated to those of the validated reversed-phase liquid chromatography (RP-LC), size-exclusion liquid chromatography (SE-LC) and CZE methods, showing significant correlation (p> 0.05) Thus, the application of the validated physico-chemical methods together with in vitro bioassays, was suggested to improve quality control of rhPTH biotechnology-derived product and to support studies of biosimilars. / O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídeo produzido e secretado pelas glândulas paratireóides, e é fundamental para a manutenção da homeostase dos íons cálcio no sangue. A tecnologia do DNA recombinante possibilitou a expressão do gene do hPTH em Escherichia coli, e a produção em grande escala do hormônio da paratireóide humano recombinante (rhPTH 1-34), também denominado Teriparatida, o qual apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratôrmonio natural. O rhPTH é clinicamente indicado para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pós-menopausa, de homens com osteoporose primária ou hipogonadal, e da osteoporose associada à terapia sistêmica com glicocorticóides. Neste trabalho foi desenvolvido e validado método por eletroforese capilar de zona (ECZ) para a avaliação de rhPTH em produtos biofarmacêuticos. No método por ECZ, utilizou-se capilar de sílica fundida (40 cm de comprimento efetivo x 50 μm d.i.) e solução eletrolítica composta de fosfato de sódio dihidrogenado 50 mM, pH 3,0. O capilar foi mantido a temperatura de 25ºC, e a tensão aplicada foi de 20 kV. O tempo de injeção foi de 45 s, com pressão de 50 mBar, e detecção por arranjo de diodos (DAD), em 200 nm. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 5,3 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,25-250 μg/mL (r2 = 0,9992). Os limites de detecção e quantificação foram de 0,12 e 0,40 μg/mL, respectivamente. A especificidade foi avaliada através de análises com os excipientes da formulação biofarmacêutica e estudos de degradação, demonstrando a seletividade do método. A exatidão foi 100,28% com bias inferior a 0,85%. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, apresentando, para as amostras submetidas às condições ácida, fotolítica e térmica, diferença significativa (p< 0,05) em relação à molécula íntegra. Os bioensaios de proliferação celular e da atividade da fosfatase alcalina em células UMR-106 foram desenvolvidos e aplicados para avaliação da atividade biológica de rhPTH em formulações biofarmacêuticas. Os resultados de teor/potência foram correlacionados com os métodos já validados por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM) e ECZ, apresentando correlação significativa (p> 0,05). Assim, sugere-se que o métodos físico-químicos validados sejam aplicados paralelamente aos bioensaios in vitro para aprimorar o controle da qualidade do produto biotecnológico de rhPTH, e para avaliação da biossimilaridade de rhPTH.

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