Le rétinoblastome est un cancer pédiatrique rare de la rétine en cours de développement. Si dans les pays développés, le taux de survie avoisine 100%, une énucléation de l’oeil atteint est cependant nécessaire dans plus de 70% des cas.En 1971, Knudson émit l’hypothèse des deux “hits”, qui permit de comprendre que le rétinoblastome s’initie généralement après une perte bi-allélique du gène RB1. Cependant, les autres mécanismes moléculaires qui régissent ce cancer restent depuis peu connus. Par exemple, peu d’études génomiques ont été conduites. Ainsi, la nature de la cellule d’origine, ainsi que la présence ou non d’une hétérogénéité intertumorale, font encore débat. Dans cette étude, nous avons dressé un portrait génomique et clinique complet du rétinoblastome; plusieurs observations ont montré qu’il s’agit bien d’une maladie hétérogène, avec deux sous-types distincts. Nous avons d’abord identifié les deux sous-types avec à une approche couplant une analyse en composantes indépendantes (ACI) de transcriptomes tumoraux avec des marquages immunohistochimiques. Les rétinoblastomes du premier sous-type, dits “cone-like” expriment uniformément des marqueurs de cônes, tandis que ceux du second sous-type, dits “bivalent-type”, ont une forte hétérogénéité intratumorale, avec un enchevêtrement de zones de différenciation ganglionnaire ou cône. Grâce à une étude plus approfondie des transcriptomes et de données d’altérations génomiques, nous avons ensuite montré que les sous-types dépendent de voies de signalisation et d’oncogènes différents. Les bivalent-type ont notamment une présence quasi-systématique de gains de MDM4 ou d’amplifications de MYCN. Nous nous sommes ensuite tournés vers les méthylomes des rétinoblastomes, et constaté une forte hétérogénéité entre les sous-types. Nous avons décomposé cette hétérogénéité grâce à une ACI, et constaté qu’elle n’était pas liée uniquement à la différenciation cône ou ganglion. Nous avons ensuite étudié les données cliniques de la cohorte, et constaté que les sous-types avaient des âges au diagnostic et des formes de croissance différents, les tumeurs cone-like se developpant généralement chez des patients jeunes avec des tumeurs exophytiques, et les bivalent-type chez des patients plus âgés avec des tumeurs endophytiques. De plus, les patients avec des inactivations constitutionnelles du gène RB1 développent majoritairement des tumeurs cone-like; les cone-like s’initieraient donc plus tôt durant le développement de la rétine. Nous avons finalement séquencé les exomes de 74 paires tumeur-normal. Les rétinoblastomes avaient un taux de mutations extrêmement faible (0.1 mutations par mégabase), comme beaucoup de cancers pédiatriques. Nous avons identifié des mutations somatiques récurrentes dans RB1, BCOR et ARID1A. Ces gènes se trouvaient de plus dans des régions minimales de pertes chromosomiques. Surtout, les inactivations des deux gènes avaient souvent de fortes fréquences alléliques. Ceci indique que ces inactivations ont lieu précocément dans la tumorigénèse. En conclusion, notre étude a permis de dresser un premier portrait génomique complet du rétinoblastome, a révélé l’existence de deux sous-types distincts, ainsi que fourni des indices quant à la cellule d’origine de chaque sous-type, et les mécanismes moléculaires les régissant. / Retinoblastoma is a rare pediatric cancer of the developing retina. In high-income countries, survival rates near 100%; however, enucleation of the affected eye has to be performed in over 70% of patients. Knudson’s 1971 two-hit hypothesis led to the discovery that this cancer usually initiates after a bi-allelic loss of the RB1 gene. Despite this early finding, little is known about the other molecular underpinnings of retinoblastoma. For instance, few genome-wide studies have described the genetic and epigenetic characteristics of these tumors. Furthermore, there is still no clear consensus regarding this cancer’s cell of origin, or whether or not it is homogenous disease. In this study, we built a comprehensive molecular and clinical portrait of retinoblastoma. Several lines of evidence led us to conclude that retinoblastoma is in fact a heterogeneous disease, with two distinct subtypes. We first uncovered the subtypes through a strategy that coupled an independent component analysis (ICA) of tumor transcriptomes to tumor immunohistochemical stainings. Retinoblastomas of the first subtype, called “cone-like”, homogeneously display cone-like differentiation, while those of the second subtype, called “bivalent-type”, exhibit strong intratumoral heterogeneity, with areas of cone-like differentiation intertwined with areas of ganglion-like differentiation. Further analysis of the transcriptomic data, as well as of copy number alteration data revealed that both subtypes may rely on different pathways and oncogenes. We notably observed a quasi-systematic presence of MDM4 gains or MYCN amplifications in bivalent-type tumors. We next turned to retinoblastomas’ methylomes; these considerably varied between the subtypes. ICA allowed us to decompose this inter-subtype methylomic heterogeneity, which was found to go beyond methylation due to cone-like or ganglion-like differentiation. We next studied the tumors’ clinical data, and found that cone-like tumors are most often diagnosed in very young patients with exophytic tumor growth, while bivalent-type tumors are found in older patients with endophytic tumor growth. Furthermore, patients with germline inactivations of RB1 mostly developed cone-like retinoblastomas, indicating that these tumors may initiate earlier during retinal development. In the final part of our study, we performed whole exome sequencing of 74 tumor-normal pairs. Like many pediatric cancers, the tumors had very low background mutation rates (0.1 mutations per megabase). Recurrent somatic mutations were found in RB1, BCOR and ARID1A, and these genes were also found to be in minimal regions of chromosomal losses. Importantly, both inactivations often had very high allelic frequencies, indicating that these events occur very early on in retinoblastoma tumorigenesis.Taken together, our study outlines a first comprehensive genomic portrait of retinoblastomas, points to the existence of two distinct subtypes, and provides insights into the cells-or-origin and the molecular mechanisms underlying these subtypes.

Les progrès des technologies de séquençage ont joué un rôle important dans le diagnostic moléculaire des maladies rares, telles que les myopathies et les dystrophies musculaires. Cependant, plusieurs patients atteints de maladies neuromusculaires restent sans diagnostic. Ceci est dû à la grande hétérogénéité clinique et génétique ainsi qu'au caractère hautement polymorphique des gènes associés à ces troubles. L'interprétation des données génétiques est un grand défi et les tests génétiques aboutissent souvent à l'identification de variants de signification inconnue (VUSs). Plusieurs de ces variants peuvent perturber l'épissage normal de l'ARN ou affecter l'expression des gènes. À cet égard, nous proposons une approche bio-informatique. Notre objectif est de mettre en place un pipeline identifiant et caractérisant des variants d'intérêt dans un contexte pathologique. Afin de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel, notre pipeline se concentre sur l'épissage alternatif ainsi que sur l'intégration des données génomiques et transcriptomiques. Nous émettons l'hypothèse qu'une partie des patients sans diagnostic pour leur maladie neuromusculaire s'explique par des variants introniques jouant un rôle régulateur ou affectant l'épissage et l'abondance de l'ARNm. Cette approche multi-omique permet de déterminer si les variants ont un impact fonctionnel. Pour ce faire, nous avons réalisé un séquençage de l'ARN et de l'ADN à partir de biopsies musculaires de quatre patients. Les données ont été alignées et annotées avec différents scores de pathogénicité. Les événements d'épissage sont analysés par SpliceAI et rMATS. L'analyse des gènes différentiellement exprimés a été réalisée par l'outil LPEseq. Les CNVs et les expansions de répétitions ont été analysés avec CNVkit et ExpansionHunter. Plusieurs scripts maison filtrent et intègrent les données ARN et ADN. Pour l'instant, un total de huit variants pathogéniques sont proposés pour nos patients, mais des investigations supplémentaires sont nécessaires. Les variants recherchés sont rares et nécessitent donc un pipeline cohérent et efficace. Ce projet apportera un bénéfice significatif pour les patients en leur permettant d'obtenir un diagnostic et ainsi d'avoir accès à un meilleur suivi clinique. / Advances in sequencing technologies have played an important role in the molecular diagnosis of rare diseases, such as myopathies and muscular dystrophies. However, several patients with these neuromuscular diseases remain undiagnosed. This is due to the great clinical and genetic heterogeneity as well as the highly polymorphic nature of the genes associated with myopathies and muscular dystrophies. The interpretation of genetic data is a great challenge and genetic testing often results in the identification of variants of uncertain significances (VUSs). Many of these variants can disrupt normal RNA splicing or affect gene expression. In this regard, we propose a bioinformatics approach. Our aim is to put in place a pipeline identifying and characterizing variants of interest in a pathological context. To determine if the variants have a functional impact, our pipeline focuses on alternative splicing as well as the integration of genomic and transcriptomic data. We hypothesize that a portion of patients without a diagnosis for their neuromuscular disorder is explained by intronic variants having a regulatory role or affecting mRNA splicing and abundance. This multi-omics approach will make it possible to determine whether the variants have a functional impact. To do so, we performed RNA and DNA sequencing using muscle biopsies from four patients. Data was aligned and annotated with different pathogenicity scores. Splicing events are analyzed by SpliceAI and rMATS. The analysis of the differentially expressed genes was carried out by the LPEseq tool. CNVs and repeat expansion were analyzed with CNVkit and ExpansionHunter. Several in-house scripts filter and integrate RNA and DNA data. For now, a total of eight pathogenic variants are proposed for our patients, but further investigations are needed. The variants sought are rare and therefore require a coherent and efficient pipeline to facilitate their characterization. This project will have a significant benefit for patients by allowing them to obtain a diagnosis and thus have access to better clinical follow-up.