L'effet protecteur des HDL sur les pathologies cardio-vasculaires est principalement attribué à leur rôle central dans le Transport Retour du Cholestérol (TRC). Ce processus assure l'efflux du cholestérol excédentaire des cellules périphériques vers le foie, au niveau duquel il est éliminé dans les sécrétions biliaires. Dans ce contexte, notre équipe a identifié à la surface des cellules hépatiques la présence d’un complexe enzymatique, très proche de l’ATP synthase mitochondriale, comme étant un récepteur de haute affinité pour l’apoA-I (protéine majoritaire des HDL). Cette ATP synthase de surface, également appelée ecto-F1-ATPase, joue un rôle clé dans l’endocytose hépatique des HDL. En effet, la liaison de l’apoA-I stimule l’activité ATPasique de l’enzyme, entrainant la production d’ADP extracellulaire puis l’activation spécifique du récepteur nucléotidique P2Y13, aboutissant in fine à l’endocytose des HDL. Ainsi, l’équipe a montré le rôle clé de la voie ecto-F1-ATPase/P2Y13 dans l’endocytose hépatique des HDL et par conséquent dans les effets protecteurs de ces derniers dans l’athérosclérose.Les travaux de thèse présentés ici visent à déterminer les mécanismes de régulation de cette ecto-F1-ATPase. Compte tenu de l’importance de la régulation des taux d’ADP et d’ATP extracellulaires dans l’endocytose des HDL, nous nous sommes intéressés dans un premier temps aux acteurs moléculaires qui pourraient réguler le métabolisme nucléotidique à la surface cellulaire. Nous avons mis en évidence la présence, à la surface des cellules HepG2, de l’adénine nucléotide translocase (ANT), une autre protéine classiquement localisée à la mitochondrie. Nous avons montré que l’ecto-ANT est impliquée dans la régulation des taux des nucléotides adényliques ADP et ATP extracellulaires et que son fonctionnement est lui-même dépendant du taux de ces derniers dans le milieu extracellulaire. / The cardioprotective effect of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) is mostly attributed to their metabolic functions in reverse cholesterol transport (RCT), a process whereby excess cell cholesterol is taken up from peripheral cells and processed in HDL particles, and later delivered to the liver for further metabolism and bile excretion. ATP synthase, classically known to be located in the mitochondrial inner membrane, has been unexpectedly found expressed at the plasma membrane of hepatocytes, as a receptor for apoA-I, playing a role in HDL-cholesterol uptake. On hepatocytes, apoA-I binding to ecto-F1-ATPase stimulates extracellular ATP hydrolysis into ADP, which subsequently activates a P2Y13-mediated HDL endocytosis pathway. The strict dependence of HDL endocytosis on extracellular ADP level led us to study first, whether other plasma membrane proteins than ecto-F1-ATPase could regulate extracellular ADP level. We highlighted the presence on hepatocytes cell surface of Adenine Nucleotide Translocase (ANT), another transmembrane protein of the inner mitochondrial membrane. We showed that ecto-ANT activity could increase or reduce extracellular ADP level, depending on the extracellular ADP/ATP ratio. Furthermore, we demonstrated that pharmacological inhibition of ecto-ANT activity increased extracellular ADP level when ecto-F1-ATPase was activated by apoA-I. This increase in the bioavailability of extracellular ADP accordingly translated into an increase of HDL endocytosis in human hepatocytes. We then sought to explore the molecular mechanisms involved in targeting ecto-F1-ATPase to the plasma membrane. Indeed, F1-ATPase ectopic expression at the plasma membrane has been described on several cell types and has been related to several physiological and pathophysiological processes however, the pathway involved in its transport to the cell surface remains unknown.

English Abstract The incoming paradigm of the network (or systems) biology calls for a new high throughput tool for a wide scale study of protein-protein interactions. Mass spectrometry-based proteomics have experienced a great progress in recent years and have become an indispensable technology of elementary as well as clinical research. Glutamate carboxypeptidase II (GCPII; EC 3.5.17.21) is a transmembrane protein with two known enzymatic activities. Its expression is highly upregulated in some solid tumors and also in tumor-associated neovasculature in general. Nevertheless, none of the two enzymatic activities were shown to be physiologically relevant to these cells. Some facts point at a possible receptor function of GCPII, however, no specific binding partner has been found yet. In the search for potential binding partners and/or ligands of GCPII, a series of methods have been employed, including pull-down experiment, immunoprecipitation and mass spectrometry. Sample preparation and mass spectrometry data processing methodology was specifically developed in order to identify potential binding partners. As one of the outcome of that methodology, the interaction of β-subunit of F1 ATP synthase was selected for further detailed analysis as a putative ligand of GCPII.