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The bacterial type VI secretion system is a multicomponent molecular machine directed against eukaryotic host cells and competing bacteria. It consists of a contractile tubule that is attached to a membrane protein complex. Upon tubule contraction, a needle is ejected into target cells to translocate toxic effectors into the cell. Due to structural and functional homologies of several proteins of the secretion system to proteins of contractile bacteriophage tails, the system is generally described as an inverted phage tail. Following this analogy, the secretion process is driven by energy stored in the elongated conformation of the Type VI secretion tubule for which also partial structural homology to bacteriophage tail sheath proteins has been predicted. However, this prediction has not been corroborated by structural data so far. The AAA+ ATPase ClpV plays an important role in the secretion process, as it disassembles the contracted tubule, putatively for recycling of the complex. Even though the binding site for ClpV has been identified in VipB, the molecular mechanism which recruits the ATPase specifically to the contracted tubule is not known yet. In a collaborative project with PD Dr. Axel Mogk and colleagues at the DKFZ Heidelberg and the group of Dr. Franz Herzog at the Gene Center Munich, we investigate the structure of the Vibrio cholerae Type VI secretion tubule consisting of the proteins VipA and VipB. We employ a hybrid methods approach of cryo electron microscopic 3D reconstruction and electron microscopic and biochemical labeling techniques supported by cross-linking mass spectrometry to develop a structural model of VipA and VipB in the tubule. We are able to resolve the three-dimensional structure of the helical VipA/B tubule up to 6 Å which allows us to locate secondary structure elements. We describe the arrangement of VipA and VipB in the asymmetric unit and show that the architecture of the tubule is mainly defined by contacts between C-terminal domains of VipB which are structurally similar to domain IV of viral tail sheath proteins. By comparison to the T4 bacteriophage tail sheath, we suggest that these structurally homologous parts mediate the common function of contraction. Additionally, the VipA/B tubule has been adapted towards efficient recycling of contracted Type VI secretion systems. VipB is equipped with a specific four-helix bundle N-terminal domain which carries the ClpV binding motif. Also for VipA, no correspondency to any other known structural part of a phage-like contractile system is found. We propose that it serves as a chaperone for VipB. Based on the observed structural homologies between the T4 phage tail sheath protein and VipB, we model the elongated state of the VipA/B tubule using known low resolution structures of the elongated T4 phage tail. Furthermore, we suggest a molecular mechanism for Type VI secretion tubule recycling. In the elongated state of the tubule, the VipB N-terminal domain is hidden in the tubule wall, making the ClpV binding motif inaccessible for the ATPase. Therefore, ClpV-mediated recycling of the tubule is restricted to its contracted state. / Das bakterielle Typ-VI-Sekretionssystem ist eine aus vielen unterschiedlichen Teilen bestehende molekulare Maschine, die gegen eukaryotische Wirtszellen und konkurrierende Bakterien gerichtet ist. Sie besteht aus einem kontraktionsfähigen Tubulus, welcher mit einem Komplex aus Membranproteinen verbunden ist. Durch Kontraktion des Tubulus wird eine Nadel in eine Zielzelle gestoßen, um Gifte in die Zelle zu injizieren. Aufgrund von strukturellen und funktionalen Homologien von einigen Proteinen des Sekretionssystems zu Proteinen des kontraktionsfähigen Bakteriophagenschwanzes wird das System allgemein als umgedrehter Phagenschwanz beschrieben. In dieser Analogie wird der Sekretionsprozess durch die in der elongierten Konformation des Typ-VI-Sekretionstubulus gespeicherte Energie angetrieben. Für ihn wurde auch eine teilweise strukturelle Homologie zum Mantelprotein des Bakteriophagenschwanzes vorhergesagt, aber nie durch strukturelle Daten belegt. Die AAA+ ATPase ClpV spielt eine wichtige Rolle im Sekretionsprozess, da sie den kontrahierten Tubulus zerlegt, vermutlich zur Wiederverwertung des Komplexes. Obwohl die ClpV-Bindestelle in VipB bereits identifiziert wurde, ist der molekulare Mechanismus, der die ATPase ausschließlich an kontrahierten Tubuli binden lässt, unbekannt. In einem Kollaborationsprojekt mit PD Dr. Axel Mogk und Mitarbeitern am DKFZ Heidelberg und der Gruppe von Dr. Franz Herzog am Gen-Zentrum München, untersuchen wir die Struktur des Typ-VI-Sekretionstubulus aus Vibrio cholerae, welcher aus den Proteinen VipA und VipB besteht. Wir verbinden in unserem Ansatz die 3D-Rekonstruktion aus kryo-elektronenmikroskopischen Bildern mit elektronenmikroskopischen und biochemischen Markierungsmethoden und entwickeln ein Strukturmodell von VipA und VipB im Tubulus, welches durch den massenspektrometrischen Nachweis chemisch quervernetzter Peptide gestützt wird. Wir können die dreidimensionale Struktur des helikalen VipA/B-Tubulus bis auf 6 Å auflösen, was es uns ermöglicht, Sekundärstrukturelemente zu lokalisieren. Wir beschreiben die Anordnung von VipA und VipB in der asymmetrischen Untereinheit und zeigen, dass die Architektur des Tubulus hauptsächlich durch Kontakte zwischen C-terminalen Domänen von VipB bestimmt wird, welche strukturell der Domäne IV der Mantelproteine des Bakteriophagenschwanzes ähneln. Der Vergleich mit dem Mantel des T4 Bakteriophagenschwanzes, führt uns zu dem Vorschlag, dass diese struktur-homologen Bestandteile die gleiche Funktion in der Kontraktion besitzen. Zusätzlich ist der VipA/B-Tubulus einer effizienten Wiederverwertung des Typ-VI-Sekretionssystems angepasst. VipB besitzt eine spezielle N-terminale Domäne, die aus einem Bündel aus vier Helices besteht und das Erkennungsmotiv für ClpV trägt. Für VipA finden wir ebenfalls keine Entsprechung zu anderen phagen-ähnlichen kontraktionsfähigen Systemen. Unserer Ansicht nach dient es als Chaperon für VipB. Basierend auf den beobachteten Strukturhomologien zwischen dem Mantelprotein des T4 Bakteriophagenschwanzes und VipB, entwerfen wir unter der Verwendung von niedrig aufgelösten Strukturen des elongierten T4 Phagenschwanzes ein Modell des elongierten Zustands des VipA/B-Tubulus. Des Weiteren schlagen wir einen molekularen Mechanismus für die Wiederverwertung des Typ-VI-Sekretionstubulus vor. Im elongierten Zustand des Tubulus ist die N-terminale Domäne von VipB in der Wand des Tubulus versteckt. Daher ist das ClpV-Erkennungsmotiv für die ATPase nicht zugänglich und der Abbau des Tubulus durch ClpV auf seinen kontrahierten Zustand beschränkt.

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Die Cathepsine bilden eine Gruppe innerhalb der Cysteinproteasen, die primär an der allgemeinen Proteindegradation innerhalb der Lysosomen beteiligt ist. Daneben übernehmen sie jedoch auch zusätzliche wichtige und spezifische Funktionen im Extrazellulärraum sowie in weiteren Bereichen innerhalb der Zelle, wo sie an den unterschiedlichsten physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Cathepsin X ist ein bislang nur unzureichend untersuchter Vertreter der lysosomalen Cysteinproteasen. Man findet in verschiedenen Tumorarten eine Überexpression dieser Pro¬tease. Über Ursachen und Wirkung dieser erhöhten Cathepsin X-Expression war zu Beginn dieser Arbeit nur sehr wenig bekannt. Hinweise auf eine Beteiligung dieser Protease an Tumorerkran¬kungen liefern im Tiermodell gewonnene Daten, wonach sich ein Fehlen von Cathepsin X negativ auf die Tumorprogression auswirkt. Weiterhin belegen zahlreiche in-vitro- Studien anhand von Transwell-Experimenten eine verminderte Invasion von humanen Tumorzel¬len unter Cathepsin X-Defizienz. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, diesem Aspekt weiter nachzugehen und aufzuklären, über welche Mechanismen Cathepsin X die für Tumor¬erkrankungen entscheiden¬den zellulären Eigenschaften wie Zellproliferation bzw. invasion beeinflussen kann. Wir stellten die Hypothese auf, dass die gehemmte Invasion Cathepsin X-defizienter Tumorzel¬len möglicherweise auf Vorgänge zurückzuführen ist, die unter anderem zelluläre Seneszenz induzieren. Zelluläre Seneszenz ist ein Tumor¬suppressor¬mecha¬nis¬mus, dessen vorrangige Auf-gabe es ist, DNA-geschädigte Zellen in einen Wachstumsstopp zu überführen und somit deren Ausbreitung zu verhindern. Um zu klären, ob die zuvor beschriebenen pro-kanzerogenen Effekte von Cathepsin X auch auf physiologische Zellen zutreffen und um die zelluläre Seneszenz bei Cathepsin X-Defizienz zu untersuchen, verwendeten wir Fibroblasten zweierlei Ursprungs: neonatale normale humane dermale Fibroblasten (NHDF), deren Cathepsin X-Expression durch einen siRNA-vermittelten Knockdown unterdrückt wurde sowie murine embryonale Fibroblasten (MEF) aus Cathepsin X-/--Mäusen. Zusätzlich analysierten wir Prostatakarzinomzellen (PC-3, LNCaP), die, ebenso wie die humanen Fibroblasten, mit Cathepsin X-siRNAs behandelt wurden. Die Analysen der Cathepsin X-defizienten Zellen bestätigten unsere Hypothese einer beschleunigten zellulären Seneszenz. Neben der Ausbildung eines abgeflachten Phänotyps und der Zunahme des Zelldurchmessers konnten wir eine erhöhte Aktivität der Seneszenz-assoziierten -Galaktosidase nachweisen. Zudem konnte eine verstärkte Expression weiterer für die Seneszenz charakteristische Gene sowie ein partieller Zellzyklusarrest in G1 gezeigt werden. Im Rahmen der Untersuchungen zu den zugrunde liegenden Mechanismen der durch Cathepsin X-Defizienz ausgelösten Seneszenz wurden auch Auswirkungen auf die Autophagie festgestellt. So führte der Verlust der Protease zu verkleinerten LC3B-positiven Autophagosomen und einer Anreicherung saurer Vesikel innerhalb der Zellen. Insgesamt handelt es sich hierbei jedoch um sehr dezente Unterschiede. Sehr viel deutlichere Differenzen traten dagegen bei der Untersuchung des insulin-like growth factor (IGF)-Systems zutage. Ein Knockdown von Cathepsin X in Prostatakarzinomzellen wirkte sich wesentlich auf den IGF-I-Rezeptor (IGF-IR) aus. Während die IGF-IR-Expression zwar erhöht war, ermittelten wir eine starke Verminderung der Rezeptorphosphorylierung als Antwort auf eine Stimulation mit IGF-I. Zudem konnten Immun¬fluoreszenz-Aufnahmen belegen, dass die in Kontrollzellen deutlich erkennbare Aktivierung der focal adhesion kinase (FAK) durch den IGF-I-Rezeptor in Cathepsin X-defizienten Zellen trotz IGF-I-Zugabe ausblieb. Im Gegensatz dazu ergab eine Stimulation der Zellen mit IGF-II keine markanten Abweichungen zwischen Cathepsin X-siRNA-behandelten Zellen und den Kontroll¬zellen. Das IGF-System ist ein wesentlicher Regulator des downstream gelegenen mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signalwegs, bei dem wir ebenfalls eine differentielle Aktivierung nachweisen konnten. So war die Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinase (ERK) stark vermindert. Im Gegenzug war die Aktivierung der c-Jun N-terminal kinase (JNK) bei Cathepsin X-defizienten Zellen erhöht. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Arbeit zum ersten Mal einen Hinweis, auf welche Weise Cathepsin X die Tumorprogression begünstigen kann. Wir konnten mit unseren Experimenten zeigen, dass in Cathepsin X-defizienten Zellen eine beschleunigte zelluläre Seneszenz stattfindet. Im Umkehrschluss kann man nun die Hypothese aufstellen, dass Seneszenzmechanismen durch eine Cathepsin X-Überexpression umgangen werden können. Dabei ist es gut denkbar, dass dies nicht ausschließlich auf Cathepsin X zutrifft, sondern auch auf weitere Cathepsin-Vertreter, die ebenfalls in großen Mengen von Tumoren exprimiert werden. Mögliche Kandidaten sind beispielsweise Cathepsin B oder Cathepsin L. Dieses Wissen ist im Hinblick auf neue Therapieansätze höchst interessant, da die zelluläre Seneszenz als möglicher Angriffsunkt zur Tumorbekämpfung zunehmende Beachtung erfährt.

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