Dans cette étude, 36 génomes de souches de Bacillus publiés ont été analysés ; neuf d’entre eux ne portent pas de gènes ou opérons codant pour une synthèse de peptides par la voie non ribosomiale (NRPS). Chez les 18 souches restantes ont été détectées l’existence de gènes/opérons codant pour des molécules de type NRP nouvelles et des molécules issues d’une synthèse hybride NRPS/PKS (Polycétide synthases). L’analyse des opérons impliqués dans la synthèse des fengycines et plipastatines chez la souche de laboratoire B. subtilis 168, B. subtilis F29-3 et B. amyloliquefaciens FZB42, a montré des homologies élevées entre ces opérons et des grandes similitudes entre ces molécules de type NRP. De plus, l’importance du séquençage du génome de la souche de B. subtilis S499 a été soulevée. L’obtention d’un mutant mono-producteur de plipastatine, dérivé de B. subtilis 168, par le remplacement du promoteur natif Ppps par un promoteur constitutif PrepU associé à un gène de résistance à la néomycine (neo), n’a pas abouti. Par contre, l’inactivation de l’expression de l’opéron plipastatine chez le mutant BBG111, constitutif pour la synthèse de surfactine, par cette cassette PrepU-neo située en sens inverse de la transcription de l’opéron pps, a conduit à l’isolement du dérivé BBG140 montrant une production accrue de surfactine par rapport à la souche parentale. Les promoteurs Ppps (B. subtilis 168) et Pfen (B. subtilis BBG21) ont été clonés dans le vecteur d’expression pDG1661, portant la cassette lacZ, et intégrés dans le chromosome de la souche 168. L’expression et la régulation en différentes conditions de croissance de ces promoteurs Ppps et Pfen, comparées à celles du promoteur PsrfA de B. subtilis 168, ont été étudiées dans les mutants dérivés respectifs BBG142, BBG139 et BBG127. / In this study, 36 Bacillus strain genomes were analyzed; nine of them have no NRPS molecules while the detection of one NRPS molecule ‘Bacillibactin siderophore’ was showed for another nine strains. The other 18 strains showed the presence of 17 other new NRPS and NRPS-PKS hybrid molecules. The analysis of plipastatin or fengycin operons sequences of Bs F29-3, Bs 168 and B. amyloliqufaciens FZB42 were studied, which refer to the similarity of these molecules and clarified the importance of sequencing the Bs S499 fengycin operon which have a fengycin molecule cannot be correlated with the structure of the synthetases described in other fengycin- or plipastatin-producing strains interesting to come over the difficulty of the differentiation between fengycin and plipastatin. The obtaining of plipastatin mono-producer derivative from Bs 168 by the replacement of the plipastatin native promoter by a constitutive one Prepu was failed. The constructed plasmid with Prepu-neo gene have two types; pBG180 which couldn’t be transformed and pBG180* which has inverted Prepu-neo gene and transformed into BBG111 to obtain BBG140 which showed no plipastatin production and high surfactin production than the mother strain BBG111. The expression and the regulation of Ppps, Pfen and Psrf were studied in Bs 168 derivatives: BBG142, BBG139 and BBG127 respectively.

La souche de Bacillus subtilis ATCC 21332 produit deux familles de lipopeptides (les surfactines et les fengycines/plipastatines) qui présentent des propriétés biologiques d’intérêt. La productivité des procédés fermentaires en mode continu ou discontinu et leur extrapolation à grande échelle est limitée par des problèmes cinétiques et technologiques notamment par le transfert d’oxygène et la formation massive de mousse. Le travail réalisé porte sur la mise en œuvre d’un procédé innovant permettant la production de lipopeptides sans mousse et sur l’extraction des molécules à partir du milieu de fermentation. Après des travaux concernant l’amélioration de la production des lipopeptides par des cellules de B. subtilis immobilisées sur des supports solides, un bioréacteur à disques tournants permettant la production importante et sélective de lipopeptides a été mis en œuvre. Des concentrations de plus de 1 g L-1 de lipopeptides ont été obtenues lors des fermentations. Le transfert d’oxygène, facteur limitant primordial de ce métabolisme chez B. subtilis, a été étudié. Il a été fortement affecté par l’agitation pour toutes les configurations du bioréacteur étudiées. Pour des KLa se situant entre 0,001 et 0,003 s-1, le métabolisme est orienté vers la synthèse de fengycines qui représentent jusqu’à 80 % des lipopeptides synthétisés. La productivité en fengycine particulièrement intéressante et la simplicité de la mise en œuvre du bioréacteur permet d’envisager une extrapolation de la production à l’échelle industrielle. Simultanément à la production, des études concernant l’extraction des lipopeptides par pertraction dans un contacteur à disques tournants ont été entreprises. Les résultats obtenus sur l’extraction de la surfactine montrent le potentiel de cette technique séparative pour la récupération des lipopeptides à partir de leur milieu de fermentation. / Bacillus subtilis ATCC 21332 produces two families of lipopeptides (surfactins and fengycins/plipastatins) with different biological properties of interest. The productivity of fermentation process in batch or continuous conditions and bioreactors scale-up are limited by the problems of oxygen transfer limitation and foaming. This work presents a novel process of non-foaming production of lipopeptides in a rotating discs bioreactor and pertraction studies on the recovery of lipopeptides from fermentation broth. The improving production of lipopeptides by B. subtilis immobilized on solid supports enabled the implementation of an original bubbleless bioreactor for a selective production of lipopeptides. More than 1 g L-1 of lipopeptides was produced in this new rotating discs bioreactor. The oxygen transfer, a key factor for the metabolism of B. subtilis, was studied, also. In every studied configuration of bioreactor, the transfer of oxygen was strongly affected by the agitation conditions. At KLa in the range of 0.001-0.003 s-1, mainly fengycin was produced (up to 80% of total lipopeptides). The obtained high fengycin selectivity and the simplicity of the implementation of the rotating discs bioreactor suggest its potential scale-up. The extraction of lipopeptides by pertraction in a rotating discs contactor was studied, also. The obtained results on surfactin recovery by pertraction allow to consider this technique as suitable for lipopeptides extraction from fermentation broth.

Ce travail a pour objectif d’analyser la surproduction de fengycine par la souche de B. subtilis BBG 21, en comparant la synthèse à celle d’autres souches de Bacillus. BBG21 produisant également des surfactines, nous avons aussi analysé la co-production des lipopeptides dans cette souche. Le travail montre le rôle des promoteurs Pfen et Ppps dans la synthèse des fengycines. L’analyse de la séquence met en évidence 10 nucléotides manquants entre Ppps168 et PfenBBG21 et la modification d’un nucléotide de « l’UP element » entre BBG 21 et ATCC 21332. Dans un second temps, certaines conditions biotiques et abiotiques influençant l’expression du promoteur Pfen et la synthèse de fengycines et de surfactines ont été testées dans le dérivé BBG 208. Les sources de carbone orientent la synthèse vers une famille de lipopeptides alors que la plupart des sources d’azote permettent la cosynthèse à haut niveau des 2 molécules. Une forte expression du promoteur Pfen couplée à une synthèse importante de fengycines a été mise en évidence lorsque l’urée ou le mélange urée ammonium sont utilisés comme source d’azote et le mannitol comme source de carbone. Les conditions de température, de pH et d’oxygénation sont importantes pour la synthèse de fengycine et ces conditions sont spécifiques aux sources de carbone ou d’azote présentes dans le milieu. Enfin, nous avons étudié la synthèse des molécules chez des mutants surfactine - et pnp ase – issus de la souche Bs 168. Les résultats montrent que le régulateur srfAA affecte significativement la production de fengycines alors qu’il n’y pas action de srfAC. Chez les mutants pnpase - il y a une forte diminution des 2 lipopeptides. / This work aimed at analyzing the overproduction of fengycin in Bacillus subtilis BBG21 and then was compared to a set of Bacilli strains. As BBG21 also produces surfactin, we also studied coproduction of lipopeptides in this strain. The work highlighted the role the promotor Pfen and Ppps in the synthesis of fengicins. The analysis of sequences was unveiled 10 missing nucleotides between Ppps168 and PfenBBG21 and modification of one nucleotide of the UP element between strains BBG21 and 21332, respectively. Secondly, environmental conditions that might influence the promotor Pfen expression and synthesis of both lipopeptides were also tested in B. subtilis BBG 208. Thus, carbon sources appeared to direct synthesis of one family of lipopeptides, whilst most of nitrogen sources allowed high level of both lipopeptides co-synthesis. A strong expression of promotor Pfen and an important synthesis of fengycins were obtained with urea or urea ammonium mixture used as nitrogen source and with mannitol as carbon source. Temperature, pH and filling volume are important for fengycins synthesis and these conditions are carbon and nitrogen sources dependent. Finally we studied fengycins synthesis in surfactin and PNPase mutants derived from Bs 168. The result showed that srfAA regulator decreased fengycin synthesis whereas srfAC has not any affect. Notably, an important decrease in surfactin and fengycin was observed for PNPase mutant strains.