Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:26:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338219.pdf: 1806932 bytes, checksum: cb4e68c860e46d1c5b4be98ef954ceed (MD5) Previous issue date: 2015 / Na levedura S. cerevisiae os carboidratos sacarose, maltose e maltotriose são fermentados por vias metabólicas diferentes: a sacarose é hidrolisada pela invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), enquanto maltose e maltotriose são ativamente transportadas para dentro da célula e hidrolisadas pelas a-glicosidases presentes no citoplasma (ambas proteínas codificadas pelos genes MAL). Os genes SUC também permitem a síntese de uma forma intracelular da invertase, uma enzima com nenhuma função óbvia em leveduras. No entanto, a sacarose pode também ser metabolizada por células de levedura através dos transportadores e a-glicosidases codificados pelos genes MAL. Nossos resultados mostram que a maltotriose pode ser também eficientemente fermentada pelas células de S. cerevisiae através de seu transporte ativo mediado pela permease AGT1, um transportador MAL necessário para utilização de maltotriose, e sua hidrólise intracelular mediada pela invertase intracelular. A cepa brasileira industrial utilizada na produção de etanol combustível CAT-1 não pode fermentar maltotriose eficientemente devido ao promotor do AGT1 ser defeituoso. Para aumentar a fermentação de maltotriose por esta levedura, colocamos um promotor constitutivo (PGPD) à frente do gene AGT1 presente na cepa CAT-1, gerando a linhagem GMY05. No entanto, esta linhagem não foi capaz de fermentar eficientemente a maltotriose. Por outro lado, quando esta linhagem foi modificada para sobre-expressar a forma intracelular da invertase, por substituição da sequência sinal do gene SUC2 com o promotor constitutivo PADH1, a cepa iSUC2 obtida (GMY08) fermentou maltotriose eficientemente. Utilizando condições em que os genes MAL não são expressos, foi possível mostrar que a forma intracelular da invertase é capaz de hidrolisar a maltotriose (mas não maltose ou p-nitrofenil-a-glicosídico). Assim, os nossos resultados indicam uma sobreposição inesperada no metabolismo de sacarose e maltotriose por células de levedura, indicando que a invertase intracelular pode hidrolisar da maltotriose, e oferece novas abordagens a ser aplicadas para otimizar várias fermentações industriais que utilizam hidrolisados de amido, incluindo a panificação, produção de bebidas destiladas e cerveja, ou inclusive bioetanol.<br> / Abstract : It is well known that in the yeast S. cerevisiae the sugars sucrose, maltose and maltotriose are metabolized by different pathways: sucrose is hydrolyzed by the extracellular invertase (encoded by SUC genes), while maltose and maltotriose are actively transported into the cell and hydrolyzed by intracellular a-glucosidases (both proteins encoded by MAL genes). Furthermore, the SUC genes also allow the synthesis of an intracellular form of invertase, an enzyme with no obvious function in yeasts. We have already shown that sucrose can be metabolized by yeast cells through MAL-encoded transporters and a glucosidases. Now, our results will show that maltotriose can be efficiently fermented by S. cerevisiae cells through its active transport mediated by the AGT1 permease, a MAL transporter required for maltotriose utilization, and its intracellular hydrolysis mediated by the cytoplasmic invertase. The Brazilian industrial fuel-ethanol strain CAT-1 cannot ferment maltotriose efficiently due to a defective promoter of the AGT1 gene. To increase maltotriose fermentation by this strain, we placed a strong promoter (PGPD) in the AGT1 gene of strain CAT-1, generating strain GMY05. While the AGT1 gene was indeed over-expressed in this strain (measured by real-time PCR), maltotriose was still not fermented efficiently. However, when we over-expressed the intracellular form of invertase, by replacing the signal sequence of the SUC2 gene with the strong PPGK promoter, the resulting iSUC2 strain GMY08 fermented maltotriose efficiently. Using conditions were the MAL-encoded a glucosidases could not be expressed, we showed that the intracellular form of invertase could hydrolyze maltotriose (but not maltose or p-nitrophenyl-a-glucoside). Thus, our results indicate an unexpected overlap in sucrose-maltotriose metabolism by yeast cells, showing that the intracellular invertase allows efficient maltotriose hydrolysis, and offers new approaches that can be applied to optimize several industrial fermentation processes that use starch hydrolysates, including production of bread, distilled beverages and beer, or even bioethanol.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:27:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338958.pdf: 3638990 bytes, checksum: 23eca8bb60257059ff1c08d56f7f4c1e (MD5) Previous issue date: 2015 / A fermentação ABE (acetona-butanol-etanol) da Clostridium acetobutyli-cum ATCC 824, muito usada industrialmente até 1940, é um dos mais importantes bioprocessos industriais. Recentemente, o interesse nesse processo foi retomado devido à necessidade de substituir fontes combus-tíveis fósseis por vetores energéticos renováveis, principalmente biohi-drogênio e biobutanol. O objetivo desta tese é contribuir para uma melhor compreensão dos problemas associados com a detecção precoce e moni-toramento das mudanças fisiológicas da C. acetobutylicum ATCC 824 em fermentações tipo batelada. Pretende-se também refinar o entendimento desse comportamento variável utilizando a informação genômica dispo-nível desta bactéria e assim contribuir para mostrar como algumas ferra-mentas da Engenharia Genômica podem incorporar novas informações aos métodos tradicionais de monitoramento de bioprocessos. à proposta a incorporação em três diferentes níveis, a saber: (i) nível genômico, (ii) nível metabólico e (iii) nível fenotípico. No nível genômico, a presente pesquisa detectou que existem seis regiões de alta similaridade, nas quais foram identificados 15 genes já mapeados. O gene rpoB foi identificado como um forte candidato a marcador molecular de variabilidade fenotípi-ca. Foi proposta uma relação entre a regulação da transcrição do gene rpoB e o pH do meio de cultura. No nível metabólico, dois modelos meta-bólicos foram desenvolvidos, um modelo simplificado de 20 reações e um modelo genômico completo de 502 reações. Foi detectado que o modelo simplificado era mais adequado para detectar as mudanças fenotípicas da bactéria. Foi criado um modelo simplificado protonado que integra infor-mações do pH do meio de cultura. No nível fenotípico, a técnica de colora-ção de Gram mostrou-se eficiente na detecção precoce das mudanças fisiológicas da C. acetobutylicum. Foi demonstrada uma correlação entre os dados de fermentação e mudanças fisiológicas da parede celular da bactéria. Sugere-se, portanto, um novo método de detecção precoce e monitoramento do estado fisiológico da C. acetobutylicum ATCC 824 (e outras espécies de Clostridium) utilizando técnicas de coloração de Gram para determinar o estado fisiológico no qual a bactéria se encontra, e quais os principais produtos metabólicos da sua fermentação.<br> / Abstract : The problem of renewable and sustainable energy is challenging and requires innovative approaches. The production of biohydrogen, and biofuels in general, particularly biobutanol in the so-called ABE fermenta-tion by Clostridium acetobutylicum, discovered in 1861 by Louis Pasteur, although extensively studied, still lacks some fundamental understanding to facilitate monitoring changes in the physiological state and optimiza-tion. Here we propose a genomic engineering approach, divided in three levels: i) genomic, ii) metabolic, iii) phenotypic. At the genomic level, a comparative whole-genome study was performed comparing C. acetobu-tylicum with six other chosen microorganisms and a in silico Gram type experiment; The whole-genome analysis detected one major gene, the rpoB gene, implied in acquired antibiotic resistance, and possibly impli-cated in phenotypic variation during ABE fermentation. A possible link between the pH regulation and rpoB expression is suggested. The 16S rRNA analysis consistently showed Gram-positive classification for the C. acetobutylicum strain used, incapable of detecting the existent phenotypic variations.at the metabolic level, two metabolic network models were developed: a simplified, core model, with 20 reactions, and a genome-wide model, comprising 502 reactions; to translate the molecular and biochemical information to a useful engineering level, a phenotypic rela-tion between the Gram stain response and pH developed during batch fermentation was analyzed. The simplified core metabolic network suc-cessfully captured the observed strain metabolic profile. Additional regu-latory mechanism was added to the simplified metabolic model with the integration of pH regulation. Using the Gram staining method, we demon-strated a strong correlation between bacterial growth and morphological changes of the cell wall that is useful in monitoring early detection of the metabolic stages of C. acetobutylicum ABE fermentation. The Gram stain-ing technique is proposed as an efficient, low cost method to identify the physiological state of the bacteria culture and its connection with the fermentation state.