Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-05-03T22:43:49Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Luiza Beatriz de Medeiros Santos.pdf: 1572136 bytes, checksum: 8355a6d8912ee942f0bf2ede8ac0ebb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-03T22:43:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Luiza Beatriz de Medeiros Santos.pdf: 1572136 bytes, checksum: 8355a6d8912ee942f0bf2ede8ac0ebb0 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / CAPES / A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma alternativa de tratamento para o câncer e para infecções microbianas e parasitárias. Na TFD, a luz, o oxigênio e um agente fotossensibilizador (FS) são combinados produzindo espécies reativas capazes de induzir danos e morte celular. Como exemplos de substâncias FS tem-se as zincoporfirinas e o azul de metileno (AM) que demonstram um grande potencial para TFD, sendo objetos deste estudo. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo preparar um sistema de aplicação tópica capaz de carrear os FS (Zn(II) meso-tetrakis (N-etilpiridinio-2-il) porfirina - ZnTE-2-PyP4+ e azul de metileno) para uso em terapia fotodinâmica e avaliar a capacidade de geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) antes e após a incorporação, como também a caracterização do sistema através de análise de pH, espalhabilidade e viscosidade. Para isso, foi utilizado o gel Carbopol, comumente empregado em preparações farmacêuticas. A detecção de ROS dos FS foi então avaliada antes e após incorporação ao gel, através do método químico indireto, bem como através de caracterização por espectroscopia de absorção e emissão eletrônica. Foi observado que a ZnTE-2-PyP4+ e o azul de metileno, ainda em solução (5 µM), apresentaram boa resposta na produção de espécies reativas de oxigênio (36 e 52%, respectivamente). Ao analisar a formulação em gel contendo ZnTE-2-PyP4+, detectou-se um aumento em torno de 6% na produção de ROS se comparado à solução, enquanto que, para o gel contendo AM, houve redução em torno de 25% na geração de ROS e os resultados são discutidos em termos da interação dos FS com a estrutura do polímero formador do gel. O conjunto de resultados evidencia que existe um potencial para aplicação destes FS em gel carbopol para uso em TFD, devido à capacidade de geração de ROS. Por outro lado, como o mecanismo fotodinâmico envolve não somente a sinergia da interação da luz, do oxigênio e propriedades do fotossensibilizador, mas também o local de aplicação da formulação, mais estudos são necessários para se avaliar a aplicabilidade desses sistemas no tratamento fotodinâmico. / Photodynamic Therapy (PDT) is an alternative treatment for cancer and microbial and parasitic infections. In PDT, light, oxygen and a photosensitizer agent (PS) are combined producing reactive species capable of inducing damage and cell death. As examples of substances PS there are zinc-porphyrins and the methylene blue (MB) which demonstrate a great potential for PDT. In this context, this study aimed to prepare a topical application system capable of carrying the PS (Zn(II) meso-tetrakis (N-ethylpyridinium-2-yl) porphyrin ZnTE-2-PyP4+ - and Methylene Blue) for use in photodynamic therapy and evaluate the generation capacity of reactive oxygen species (ROS) before and after the incorporation, as well as the characterization of system by electronic absorption and emission spectroscopy, analysis of pH, viscosity and spreadability. Carbopol gel a commonly employed pharmaceutical preparations in was used for the semisolid formulation. The PS were then evaluated before and after incorporation into the gel by indirect chemical method for ROS detection and characterization of optical properties of the final systems. It was observed that aqueous solutions of 5 µM ZnTE-2-PyP4+ or MB showed a good response in the production of reactive oxygen species (36 and 52% respectively). The gel formulations containing ZnTE-2-PyP4+ displayed 6% increase in the ROS production when compared to the solution. On the other hand, the gel containing MB, showed a 25% reduction in the generation of ROS and the overall results are discussed in terms of the interaction of the FS with the polymer forming gel. The results show that there is a potential for the application of these PS in carbopol gel for use in PDT due to the ability of ROS generation. On the other hand, the photodynamic mechanism involves not only the synergistic interaction of light, oxygen and photosensitizing properties but also the application site of the formulation, and therefore, more studies are required to evaluate the applicability of these systems in topic photodynamic treatment.

A cor vermelha brilhante característica do presunto Parma é resultante, principalmente, do pigmento Zinco-protoporfirina IX (ZnPP). A ZnPP é formada a partir da mioglobina por uma reação de transmetalação, catalisada pela enzima ferroquelatase (FECH), em que o íon de Fe(II) coordenado ao grupo heme é substituído pelo íon Zn(II). O presunto Parma apresenta uma maior estabilidade oxidativa em relação aos demais produtos cárneos curados além de não conter nitrito e nitrato, portanto, são considerados mais saudáveis. A utilização da FECH no processamento de carnes curadas pode permitir a produção de produtos cárneos curados mais saudáveis e em menor tempo. No presente trabalho a proteína ferroquelatase de Bacillus subtilis (BsFECH) foi expressa em células de E. coli BL21(DE3), purificada por cromatografia de afinidade ao níquel e exclusão por tamanho e caracterizada por dicroísmo circular, emissão de fluorescência do triptofano e cromatografia de exclusão por tamanho analítico. Em termos de estabilidade foi encontrado que altas concentrações de sal aumentam a estabilidade da proteína frente aos agentes denaturantes ureia e temperatura. A BsFECH produzida é capaz de ligar-se ao substrato modelo de porfirina (TPPS), conforme verificado por espectroscopia de UV-Vis, com uma Ka = 3,8x105 M-1 e é capaz de se associar à metamioglobina, conforme verificado por reação de cross-linking com dissuccinimidil suberato e avaliado por SDS-PAGE. A BsFECH aumenta significativamente a taxa de inserção de íons de zinco na TPPS e mostra uma cinética de saturação com uma constante de ligação aparente de Zn(II) ao complexo [BsFECH-TPPS] de 1,3x104 M e uma constante de primeira ordem de 6,6x10-1 h-1 para a dissociação do complexo ternário. A reação de troca ferro/zinco na mioglobina catalisada pela BsFECH é facilitada pela proteólise limitada da mioglobina com pepsina que abre um caminho para a reação de troca metálica com base na interação proteína-proteína entre o fragmento globina da mioglobina e a BsFECH. / The bright red color, characteristic of the Parma ham, results mainly of the pigment Zinc-Protoporphyrin IX (ZnPP). The ZnPP is formed from myoglobin by the reaction, catalyzed by ferrochelatase enzyme (FECH), in which Fe(II) ions coordinated to the heme group is replaced by Zn(II) ions. Parma ham shows greater oxidative stability when compared to others cured meat products besides do not contain nitrite and nitrate and, therefore, is considered healthier. The use of FECH in the processing of cured meats may allow the production of healthier cured meat products in a shorter period of time. In this work, the ferrochelatase protein from Bacillus subtilis was expressed in E. coli BL21(DE3) cells, purified by nickel affinity chromatography and size exclusion, and characterized by circular dichroism, fluorescence emission of tryptophan and analytical size exclusion chromatography. In terms of stability, it was found that the high salt content enhances the protein stability against the denaturation agents urea and temperature. The BsFECH produced is able to bind to the porphyrin model substrate (TPPS), as verified by UV-Vis spectroscopy, with Ka = 3.8x105 M-1 and is capable to associate to metamyoglobin as verified by cross-linking reaction with dissuccinimidil suberato, as observed by SDS-PAGE. The BsFECH increases, significantly, the zinc ions insertion rate in TPPS and shows a saturation kinetics behavior with an apparent biding constant of Zn(II) to the [BsFECH-TPPS] complex of 1.3x104 M and a first order rate constant for the dissociation of ternary complex of 6.6x10-1 h-1. The Fe/Zn exchange reaction in the myoglobin as catalyzed by BsFECH is facilitated by myoglobin-limited proteolysis with pepsin that opens a reaction channel for the metallic exchange based on protein-protein interaction between the globin moiety of myoglobin and BsFECH.

A cor vermelha brilhante característica do presunto Parma é resultante, principalmente, do pigmento Zinco-protoporfirina IX (ZnPP). A ZnPP é formada a partir da mioglobina por uma reação de transmetalação, catalisada pela enzima ferroquelatase (FECH), em que o íon de Fe(II) coordenado ao grupo heme é substituído pelo íon Zn(II). O presunto Parma apresenta uma maior estabilidade oxidativa em relação aos demais produtos cárneos curados além de não conter nitrito e nitrato, portanto, são considerados mais saudáveis. A utilização da FECH no processamento de carnes curadas pode permitir a produção de produtos cárneos curados mais saudáveis e em menor tempo. No presente trabalho a proteína ferroquelatase de Bacillus subtilis (BsFECH) foi expressa em células de E. coli BL21(DE3), purificada por cromatografia de afinidade ao níquel e exclusão por tamanho e caracterizada por dicroísmo circular, emissão de fluorescência do triptofano e cromatografia de exclusão por tamanho analítico. Em termos de estabilidade foi encontrado que altas concentrações de sal aumentam a estabilidade da proteína frente aos agentes denaturantes ureia e temperatura. A BsFECH produzida é capaz de ligar-se ao substrato modelo de porfirina (TPPS), conforme verificado por espectroscopia de UV-Vis, com uma Ka = 3,8x105 M-1 e é capaz de se associar à metamioglobina, conforme verificado por reação de cross-linking com dissuccinimidil suberato e avaliado por SDS-PAGE. A BsFECH aumenta significativamente a taxa de inserção de íons de zinco na TPPS e mostra uma cinética de saturação com uma constante de ligação aparente de Zn(II) ao complexo [BsFECH-TPPS] de 1,3x104 M e uma constante de primeira ordem de 6,6x10-1 h-1 para a dissociação do complexo ternário. A reação de troca ferro/zinco na mioglobina catalisada pela BsFECH é facilitada pela proteólise limitada da mioglobina com pepsina que abre um caminho para a reação de troca metálica com base na interação proteína-proteína entre o fragmento globina da mioglobina e a BsFECH. / The bright red color, characteristic of the Parma ham, results mainly of the pigment Zinc-Protoporphyrin IX (ZnPP). The ZnPP is formed from myoglobin by the reaction, catalyzed by ferrochelatase enzyme (FECH), in which Fe(II) ions coordinated to the heme group is replaced by Zn(II) ions. Parma ham shows greater oxidative stability when compared to others cured meat products besides do not contain nitrite and nitrate and, therefore, is considered healthier. The use of FECH in the processing of cured meats may allow the production of healthier cured meat products in a shorter period of time. In this work, the ferrochelatase protein from Bacillus subtilis was expressed in E. coli BL21(DE3) cells, purified by nickel affinity chromatography and size exclusion, and characterized by circular dichroism, fluorescence emission of tryptophan and analytical size exclusion chromatography. In terms of stability, it was found that the high salt content enhances the protein stability against the denaturation agents urea and temperature. The BsFECH produced is able to bind to the porphyrin model substrate (TPPS), as verified by UV-Vis spectroscopy, with Ka = 3.8x105 M-1 and is capable to associate to metamyoglobin as verified by cross-linking reaction with dissuccinimidil suberato, as observed by SDS-PAGE. The BsFECH increases, significantly, the zinc ions insertion rate in TPPS and shows a saturation kinetics behavior with an apparent biding constant of Zn(II) to the [BsFECH-TPPS] complex of 1.3x104 M and a first order rate constant for the dissociation of ternary complex of 6.6x10-1 h-1. The Fe/Zn exchange reaction in the myoglobin as catalyzed by BsFECH is facilitated by myoglobin-limited proteolysis with pepsin that opens a reaction channel for the metallic exchange based on protein-protein interaction between the globin moiety of myoglobin and BsFECH.