Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2015-05-26T15:12:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leandro, Danilo de Carvalho. Doutorado Acadêmico em Biologia.pdf: 5056189 bytes, checksum: 0f4442baabaf84edda19f8013a0c4012 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T15:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Leandro, Danilo de Carvalho. Doutorado Acadêmico em Biologia.pdf: 5056189 bytes, checksum: 0f4442baabaf84edda19f8013a0c4012 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / FACEPE / O mosquito Aedes aegypti, devido à sua importância na transmissão do vírus dengue, vem sendo estudado para compreensão de aspectos relacionados à competência vetorial. Os ovários, importante órgão envolvido na reprodução do vetor e implicado na transmissão viral transovariana, tem sido negligenciados nas análises de infecção viral. Diante disso, o presente trabalho analisou diversos aspectos da transmissão transovariana, como a cinética de infecção dos ovários pelo vírus Dengue, as taxas de transmissão transovariana na primeira geração filial (F1), a influência viral na fertilidade e fecundidade vetorial, os aspectos citopatológicos e ultraestruturais provocados pelo vírus no tecido ovariano, bem como a expressão diferencial de genes de resposta imune e pró-apoptóticos em ovários de A. aegypti. Experimentos de infecção artificial com vírus Dengue sorotipo 2 (DENV-2) foram conduzidos em laboratório, utilizando a população de A. aegypti proveniente de campo (Petrolina). Para as análises de cinética de infecção ovariana ao 7º, 14º, 21º e 28º dia após a infecção (dpi), dois grupos experimentais foram analisados: grupo alimentação única (AU) e grupo múltiplas alimentações (MA). Investigações das taxas de transmissão viral transovariana foram conduzidas a partir da detecção viral em mosquitos machos e fêmeas, oriundos de ovos de insetos que receberam alimentação sanguínea infectada. Experimentos de fertilidade e fecundidade foram conduzidos em fêmeas que realizaram o repasto sanguíneo infectado, e posteriormente foram individualizadas para coleta de ovos. Ovários foram coletados ao 14º dpi e submetidos a processamento e análise histopatológica e ultraestutural. Análises da expressão diferencial dos genes Relish-1 (via Toll), Hop (Via JAK-STAT), Argonaute 2 (mecanismo de RNA de interferência), e dos genes envolvidos na via apoptótica Caspase 16, AeDronc, Ae IAP1, foram conduzidas em ovários de fêmeas do grupo infectado positivas para o DENV-2, no grupo infectado negativo para o DENV-2, no grupo controle, e posteriormente comparadas pelo método ΔΔCt. A positividade para o DENV-2 no tecido ovariano foi registrada ao 14º, 21º e 28º dpi nos dois grupos (AU e MA). A quantificação viral das amostras positivas para DENV-2 apresentou resultados muito similares, com exceção do 28º dpi do grupo MA. A transmissão transovariana na F1 foi registrada apenas em machos ao 14° e 21º dia após a emergência, com 13,3% e 20% de positividade, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi observada nos padrões reprodutivos (fecundidade e fertilidade) nas fêmeas infectadas. Nas análises histopatológicas, observou-se uma invaginação do epitélio folicular dos oócitos do grupo infectado. Nenhuma alteração a nível ultraestrutural foi observada. A expressão de todos os genes avaliados foi maior nos ovários do grupo infectado positivo para o DENV-2, quando comparado a ovários do grupo infectado negativo e controle. A infecção ovariana e a transmissão transovariana ocorrem a níveis muito reduzidos, porém, quando o vírus está presente no tecido ovariano, os títulos virais são muito similares a outros órgãos relatados na literatura. A expressão de genes envolvidos na resposta imune do hospedeiro ao vírus justifica a baixa infectividade, uma vez que se observa no ovário do grupo infectado, a expressão aumentada de todos os genes avaliados. Diante disso, concluímos que a transmissão transovariana é um evento raro e que não causa alterações importantes na biologia reprodutiva do vetor, porém, não deve ser negligenciada, uma vez que é a principal forma da permanência viral nas populações de mosquitos. / The mosquito Aedes aegypti, due to its importance in the transmission of the dengue virus, has been studied for the comprehension of aspects related to vector competence. The ovaries, important organ involved in the reproduction of the vector and implied in the viral transovarian transmission, have been neglected in the analysis of viral infection. Accordingly, the present study analyzed several aspects of the transovarian transmission as the kinetics of the ovaries infection by the dengue virus, the taxes of the transovarian transmission in the first filial generation (F1), the viral influence in the vector fertility and fecundity, the cytopathological and ultrastructural aspects motivated by the virus in the ovarian tissue, as well as the differential expression of the genes of immune response and pro-apoptotic in A. aegypti ovaries. Experiments of the artificial infection with the Dengue virus serotype 2 (DENV-2) were performed in laboratory by A. aegypti population derived from the field (Petrolina). For the analysis of the kinetics of ovarian infection to the 7th, 14th, 21st and 28th day post the infection (dpi), two experimental groups were analyzed: unique alimentation group (UA) and multiple alimentations group (MA). Investigations of the taxes of transovarian transmission were conducted starting from the viral detection in male and female mosquitoes coming from the eggs of insects which received infected blood alimentation. Fertility and fecundity experiments were directed in females which reached the infected blood repast and subsequently were individualized for the eggs collection. Ovaries have been collected to the 14th dpi and submitted to the process and histopathology and ultra-structural analysis. Analysis of differential gene process Relish-1 (Toll pathway), Hop (JAK-STAT pathway), Argonaute 2 (mechanism of the RNA interference), and of the genes involved in the via apoptotic Caspase 16, AeDronc, Ae IAP1 were conducted to the ovaries of females in the infected group positive for DENV-2 in the group infected negative for the DENV-2 and in the control group and afterwards compared by the method ΔΔCt. The positivity for the DENV-2 in the ovarian tissue was registered to the 14th, 21st and 28th dpi in the two groups (UA and MA).The viral quantification of the positive samples for DENV-2 presented similar results, with the exception of 28th dpi from the group MA. The transovarian transmission in the F1 was registered only in males in their 14th and 21st after the emergency, with 13,3% and 20% of positivity respectively. No significant difference was observed in the reproductive standards (fertility and fecundity) in the infected females. In the histopathology analysis, it was observed an invagination of the follicular epithelium of the oocytes of the infected group. No alteration to the level ultrastructural was observed. The expression of all evaluated genes was bigger in the ovaries from the infected group positive for the DENV-2, when compared to the ovaries of the infected group negative and control. The ovarian infection and the transovarian transmission happen in vey reduced levels, but if the virus is present in the ovarian tissue, the viral titles are very similar to the other organs related to the literature. The expression of the genes involved in the immune response of the host to the virus justifies the low infectivity, once it was observed in the ovary of the group infected, the expanded expression of all evaluated genes. Faced with this, we may conclude that the transovarian transmission is a rare event and that cannot cause important alterations in the vector reproductive biology, but it should not be neglected, once it is the main way of the viral permanence in the mosquitoes’ populations.