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Intermediate filaments, microtubules and microfilaments are the major components of the cytoskeleton. Though it is known that intermediate filaments play an important role in the mechanical behaviour of cells, it is surprising that their mechanical properties are far from being fully understood. The morphology and assembly process of the vimentin intermediate filaments (IFs) were studied using transmission electron microscopy (TEM) and atomic force spectroscopy (AFM). The width of the vimentin was found to change as the assembly proceeded. This finding agrees with the literature about the compaction process of vimentin IFs. The width of the IFs decreased gradually, while the range of width increased within the first few minutes after assembly initiation, and then decreased at last and became stable at 12.80±2.20nm. The average length of the IFs increased with decreasing rate. The length attained 485.60±162.23nm at 120 minutes. The range of length increased which revealed the assembly process was randomly occurring between filaments in the solution. The height of the IFs obtained with AFM did not show the periodicity in contrary to the literature. It may be due to the flattening of IFs on the functionalized mica(AP-mica) surface, or the periodicity was not prominent to be observed morphologically. In the force spectroscopy study, the nanomechanical properties of individual vimentin intermediate filaments were studied using AFM. Fresh vimentin intermediate filaments and samples fixed with glutaraldehydewere examined, and force-displacement curves with nano-scale resolutions of different vimentin intermediate filament samples were analysed. The use of glutaraldehydefixative provided cross-linking of the IF, and the structural change will result in differences in their force-displacement curves which helped to provide comparison with the non-fixed samples in order to identify the structure-mechanical property relationship. Statistical studies of these curves revealed that tearing off of protofilaments from the mature intermediate filaments (with and without glutaraldehyde) occurred inthe low force regime below 100pN, and successive tearing off events were observed readily below 25 nm separations, which were comparable with the lengths of domains of around 20 nm. Different features of sawtooth indicated the possibility of sliding mechanism in vimentin IF, and the sliding was found to occur at 30.44±13.41pN. Helical domain unfoldings were observed only in the non-fixed samples to start at 10.19±5.63pN on average witha mean increase of 42.12±26.74nm. This force agreed with the prediction of the extended Bell model described in the literature and the length increase was around double of the domain length, which indicated the uncoiling of the coiled-coils. The force-displacement curves also reveal different modes of failure of the vimentin intermediate filaments including protofilaments slippage/sliding and entropic elasticity. A new tearing off model was hence proposed based on different modes of failure and a previous model developed for desmin filaments reported in literature. / published_or_final_version / Orthopaedics and Traumatology / Doctoral / Doctor of Philosophy

Recent attention has focused on the use of renewable resources as an alternative to petroleum-based polymers. Fudge et al. (2010) demonstrated that hagfish slime threads, which are composed of “keratin-like” intermediate filament (IF) proteins undergo an α→β transition when strained and when exposed to glutaraldehyde, mechanical properties further improved. Negishi et al. (2012) showed that fibres produced from solubilized hagfish slime threads did not possess comparable mechanical characteristics to native slime threads and were unable to assemble into 10 nm filaments. In this study, fibres were produced from solubilized recombinant vimentin protein and assembled vimentin filaments. Solubilized protein fibres did not display mechanical properties as impressive as fibres made from filaments assembled in the presence magnesium and glutaraldehyde. Additionally, X-ray diffraction analysis of fibres cross-linked with magnesium showed an α→β transition when draw-processed. These data show that fibres produced using IFs can potentially be used for production of sustainable protein polymers.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Titre de l'écran-titre (visionné le 24 juillet 2009). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. [82]-90. Publié aussi en version électronique.

Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 88-107). Also available online in Scholars' Bank; and in ProQuest, free to University of Oregon users.

Les protéines des FI de classe VI sont surtout caractérisées par une longue queue c-terminale. Parmi cette classe, la transitine, protéine aviaire, et la nestine, protéine des mammifères, sont deux orthologues démontrant des schémas d'expression très semblables. Elles sont abondantes dans les muscles et le système nerveux embryonnaires. Elles possèdent de plus chacune un domaine en c-terminal composé de motifs répétés, quoique aucune homologie ne soit possible entre les deux régions : il s'agit d'un motif de 7 acides aminés de type LQEEHGD pour la transitine et de 11 acides aminés de type SLEKENQEXLR pour la nestine. Il s'agit de deux domaines uniques dans les protéomes connus. Lors d'une précédente étude, une activité ATPase ainsi qu'une affinité pour les protéines des filaments intermédiaires de classe III avaient été trouvées pour le domaine HR de la transitine. Cette étude se divise en deux objectifs spécifiques : 1) Analyser la conformation du domaine répété de la transitine dans le but de comparer des éléments de structure avec des notions déjà connues et 2) Documenter la relation structurale et fonctionnelle entre la nestine et la transitine. Pour répondre au premier objectif, une approche analysant la conformation par dichroïsme circulaire a été retenue. Pour ce faire, un peptide de 7 répétitions consécutives du motif répété LQEEHGD, a été synthétisé chimiquement et des spectres comparatifs ont été obtenus en variant différents paramètres du milieu. Les spectres obtenus nous permettent de suggérer que le peptide et, par extension, le domaine HR, adopte une structure de type polyproline II. Une analyse de réactivité croisée en immunobuvardage a ensuite été réalisée sur la nestine avec un anticorps spécifique au domaine HR de la transitine, montrant une reconnaissance. Des essais de surexpression ont ensuite été fait avec le domaine répété en c-terminal de la nestine. La microscopie à fluorescence n'a pas montré la même localisation, en surexpression, pour le domaine répété de la nestine que pour celui de la transitine. De plus, aucune affinité pour d'autres protéines de filaments intermédiaires n'a pu être observée. Ces deux résultats nous font suggérer que les fonctions des domaines répétés de la nestine et de la transitine diffèrent. Nous avons finalement caractérisé plus a fond l'activité ATPase du domaine HR de la transitine, notamment en tentant de la recréer par un peptide synthétique. Les résultats obtenus semblent indiquer que cette activité n'est pas seulement dépendante d'une séquence primaire.

Les filaments intermédiaires (FIs) constituent, avec les microtubules et les microfilaments, le cytosquelette. Les kératines (Ks) donnent des FIs hétérodimériques et constituent la famille la plus diversifiée des protéines FIs. Les modèles in vitro utilisés dans les analyses du rôle des FIs K8/K18 reposent principalement sur l'utilisation de cultures primaires d'hépatocytes, isolés de souris de type sauvage ou dépourvues de la K8 ou K18, mais ces cellules différenciées ne peuvent être établies en lignées. Le laboratoire d'accueil possède une lignée cellulaire MT499cl8.3 (MGT) dépourvue du gène de la K8. Par ailleurs, une lignée clonale (MGTK8) a été établie par infection de ces cellules avec un vecteur rétroviral contenant un ADNc de la K8 humaine. Le but de mes travaux de maîtrise a donc été de vérifier l'utilité de ces lignées MGT et MGTK8, comme modèles d'études fonctionnelles de la K8 dans les cellules de l'épithélium simple. La première série de résultats, découlant de l'analyse du phénotype, montre que la lignée MGT exprime les K7, K18 et K19 à un faible niveau, tout en étant bien sûr dépourvue en K8. Par contre, la réexpression du gène de la K8 entraîne une augmentation des K7, K18 et K19. Au plan fonctionnel, ces lignées ont permis de vérifier la contribution des Ks lors de la réponse apoptotique de cellules épithéliales suite à une stimulation du récepteur Fas, à leur activité prolifératrice à la suite de l'ajout des facteurs de croissance, ainsi qu'au degré d'interactions intercellulaires et cellule-substrat. De plus, les cellules MGT s'étalent plus lentement, un retard associé à une activation différentielle des voies ERK et AKT. Enfin, la K8 agit comme un modulateur de la motilité cellulaire. Ainsi, les lignées MGT et MGTK8 constituent un modèle de choix dans toute démarche expérimentale visant à cerner le caractère multifonctionnel de la K8.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1997. / "December 1997." Typescript. Vita. Includes bibliographical references (l. 176-196). Also available on the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 1997. / "December 1997" Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves: 176-196). Also available on the Internet.