Les filaments intermédiaires (FIs) constituent, avec les microtubules et les microfilaments, le cytosquelette. Les kératines (Ks) donnent des FIs hétérodimériques et constituent la famille la plus diversifiée des protéines FIs. Les modèles in vitro utilisés dans les analyses du rôle des FIs K8/K18 reposent principalement sur l'utilisation de cultures primaires d'hépatocytes, isolés de souris de type sauvage ou dépourvues de la K8 ou K18, mais ces cellules différenciées ne peuvent être établies en lignées. Le laboratoire d'accueil possède une lignée cellulaire MT499cl8.3 (MGT) dépourvue du gène de la K8. Par ailleurs, une lignée clonale (MGTK8) a été établie par infection de ces cellules avec un vecteur rétroviral contenant un ADNc de la K8 humaine. Le but de mes travaux de maîtrise a donc été de vérifier l'utilité de ces lignées MGT et MGTK8, comme modèles d'études fonctionnelles de la K8 dans les cellules de l'épithélium simple. La première série de résultats, découlant de l'analyse du phénotype, montre que la lignée MGT exprime les K7, K18 et K19 à un faible niveau, tout en étant bien sûr dépourvue en K8. Par contre, la réexpression du gène de la K8 entraîne une augmentation des K7, K18 et K19. Au plan fonctionnel, ces lignées ont permis de vérifier la contribution des Ks lors de la réponse apoptotique de cellules épithéliales suite à une stimulation du récepteur Fas, à leur activité prolifératrice à la suite de l'ajout des facteurs de croissance, ainsi qu'au degré d'interactions intercellulaires et cellule-substrat. De plus, les cellules MGT s'étalent plus lentement, un retard associé à une activation différentielle des voies ERK et AKT. Enfin, la K8 agit comme un modulateur de la motilité cellulaire. Ainsi, les lignées MGT et MGTK8 constituent un modèle de choix dans toute démarche expérimentale visant à cerner le caractère multifonctionnel de la K8.

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie orpheline dermatologique qui a une prévalence mondiale de 1/50 000 à 1/30 000. Elle est caractérisée par des mutations transmises de manière autosomale dominante dans les gènes de la kératine 5 (KRT5) et 14 (KRT14), menant à une agrégation des filaments intermédiaires. Phénotypiquement, il y a présence d’ampoules causées par un décollement de l’épiderme. Jusqu’à présent, aucune thérapie efficace n’est disponible. Dans cette étude, des essais cellulaires évaluant le potentiel thérapeutique de deux chaperonnes chimiques, le triméthylamine N-oxyde (TMAO) et le sodium 4-phénylbutyrate (4-PBA), ont été réalisés. Pour ce faire, trois lignées immortalisées de kératinocytes de patients EBS ayant une mutation dans KRT14 et une lignée contrôle ont été utilisées pour déterminer la capacité des molécules à réduire le nombre de cellules ayant des agrégats. Les résultats ont montré un effet bénéfique significatif du TMAO seulement, et ce dans deux lignées uniquement. Ainsi, le TMAO se qualifie comme une approche thérapeutique potentielle.

Les filaments intermédiaires (FIs), de concert avec les microfilaments (MFs) et les microtubules (MTs), forment le cytosquelette. Contrairement aux quelques gènes qui codent pour les MFs d’actine et les MTs, exprimés dans toutes les cellules de l’organisme, les protéines des FIs sont codées par un grand nombre de gènes et classées en 6 types, selon la nature du tissu et l’état de différenciation des cellules. Pour leur part, les kératines s’expriment en paire dans les différents épithéliums. Plus précisément, la paire de kératines 8/18 (K8/K18) est présente dans toutes les cellules de l’épithélium simple, avec certaines cellules possédant une seconde paire. En revanche, la paire K8/K18 forme les seuls FIs retrouvés chez les hépatocytes et les cellules d’hépatome, d’où l’intérêt d’utiliser ces deux modèles cellulaires dans des études à visée fonctionnelle. Comme pour tous les autres types de FIs, les FIs K8/K18 contribuent au maintien de l’intégrité des cellules hépatiques. Par ailleurs, l’utilisation de souris transgéniques a permis d’entrevoir un rôle marquant pour ces FIs, en tant que partenaires de plateformes signalétiques chez les cellules épithéliales hépatiques. Le foie exerce un rôle primordial dans la régulation de la glycémie, du fait de sa capacité à stocker et à redistribuer d’importantes quantités de glucose à travers l’organisme, selon les besoins. Cette modulation est finement régulée par l’insuline via l’activation de son récepteur (RI) et de la signalisation qui s’en suit. Des anomalies au niveau de cette régulation conduisent à des maladies métaboliques, particulièrement au niveau du foie. À ce titre, l’accumulation récente de données expérimentales suggère une contribution des FIs K8/K18 dans la modulation du métabolisme du glucose et de la voie RI/PI3K/Akt. Cependant, la relation croisée entre cette paire de FIs, le métabolisme du glucose et cette voie signalétique, de même que les mécanismes moléculaires sous-jacents, demeure énigmatique. Les travaux dévoilés dans cette thèse examinent l’implication des FIs K8/K18 dans la régulation de la voie de signalisation et du trafic vésiculaire du RI chez les cellules hépatiques. L’approche expérimentale s’appuie sur la mise en culture d’hépatocytes ou de cellules d’hépatome dépourvues ou non de FIs K8/K18, en combinaison avec l’utilisation de diverses méthodes biochimiques et d’imagerie cellulaire. Les résultats révèlent pour la première fois, un rôle des FIs K8/K18 dans la signalisation dépendante des phosphoinositides (PIPs) initiée à la membrane plasmique, laquelle se reflète sur l’activation de la voie PI3K/Akt en réponse à l’insuline, et le trafic endosomal du RI via Rab5/EEA1/PI3P, chez des hépatocytes en culture primaire. Par ailleurs, chez les cellules d’hépatome, les résultats montrent une intervention des FIs K8/K18 dans la modulation de la signalisation et du trafic vésiculaire du RI, qui diffère grandement de celle observée chez les hépatocytes. Dans l’ensemble, les résultats démontrent une contribution incontestable des FIs K8/K18 dans la régulation de la voie signalétique de l’insuline chez les cellules hépatiques. / Intermediate filaments (IFs), together with microfilaments (MFs) and microtubules (MTs), form the cytoskeleton. Unlike the few genes that code for actins and tubulins, expressed in all cells in the body, IF proteins are coded by a large number of genes, classified into 6 types, depending on the tissue and cell differentiation status. For their part, keratins are expressed in pairs in the different epithelia. In more specific terms, the keratin pair 8/18 (K8/K18) is present in all simple epithelia, with some cells containing a second pair. In contrast, the K8/K18 pair forms the only IF network found in hepatocytes and hepatoma cells, hence their usefulness as cell models for addressing functional issues. As for all other IF types, K8/K18 IFs contribute to the maintenance of liver cell integrity. In addition, the use of transgenic mice has allowed to foresee a significant role for these IFs, as partners of signaling platforms in hepatic epithelial cells. The liver exerts a key task as regulator of blood glucose level, due to its ability to store and redistribute large amount of glucose throughout the body, as required. This modulation is finely regulated by insulin via the activation of its receptor (IR) and the downstream signaling pathway. Perturbations in this regulation lead to metabolic diseases, particularly in the liver. As such, recent experimental data suggest a contribution of K8/K18 IFs in the modulation of glucose metabolism and IR/PI3K/Akt pathway. However, the interplay between the IF pair, glucose metabolism and the signaling pathway, as well as the underlying molecular mechanisms, remain enigmatic. The work unveiled in this thesis examines the involvement of K8/K18 IFs in the regulation of the IR signaling pathway and vesicular trafficking in liver cells. The experimental approach is based on the use of cultured hepatocytes and hepatoma cells, which may or may not contain K8/K18 IFs, in combination with the use of assorted biochemical and cell imaging assays. The results uncover a role of K8/K18 IFs in the interplay taking place between the phosphoinositide-dependent signaling (PIPs) initiated at the plasma membrane, which reflects itself into the activation of the PI3K/Akt pathway in response to the insulin stimulation of IR, and its endosomal trafficking via Rab5/EEA1/PI3P, in hepatocytes. In comparative terms, the results using hepatoma cells show an intervention of K8/K18 IFs in the modulation of the IR signaling and vesicular trafficking, which differs greatly from the one observed in hepatocytes. Overall, the results demonstrate an indisputable contribution of K8/K18 IFs in the regulation of the insulin signaling pathway in hepatic cells.

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est caractérisée par un décollement intra-épidermique au niveau de la couche basale de l’épiderme aboutissant à la formation de bulles et de cloques cutanées. L’EBS est causée par des mutations au niveau des gènes qui codent pour la kératine 5 (K5) ou la kératine (K14), qui sont transmises majoritairement selon un mode autosomique dominant. L’EBS affecte environ 1/50 000 à 1/30 000 personnes dans le monde et elle est considérée comme une maladie orpheline. Dans cette étude, les kératinocytes ont été isolés de biopsies de la peau de patients atteints d’EBS ayant des mutations dans le gène KRT14 et de témoins non atteints. Des essais thérapeutiques utilisant l’interféron gamma (IFN-γ) ont été réalisés afin de stimuler la production de la K15. Les résultats ont révélé que l’IFN-γ réduit l’expression et la production de la K15 contrairement à ce que suggérait la littérature. Cette discordance pourrait s’expliquer par un effet « régulateur » de l’IFN-γ sur la K15 lorsque les cellules seraient activées. Cette hypothèse a été validée par l’augmentation de l’expression de la KRT16 qui est considérée comme un marqueur de préactivation des kératinocytes. Ainsi, l’IFN-γ ne semble pas être une cible thérapeutique potentielle pour l’EBS causée par une mutation de KTR14 (R125S).

Le tégument est formé de deux tissus, un épithélium et un mésenchyme. Il comprend la peau et la cornée. Au niveau de la face, ces derniers ont une origine embryonnaire commune: ectoderme et cellules des crêtes neurales. J'ai tout d'abord contribué à la mise en évidence de l'acquisition par le derme embryonnaire de ses capacités inductrices sur l'épiderme, et de l'indépendance de la différenciation de l'épithélium cornéen vis-à-vis de son mésenchyme, le stroma. Mes travaux principaux ont été d'établir quelle était la signature moléculaire du programme cornéen, et à quel moment et comment ce programme est mis en place chez l'embryon. La comparaison des transcriptomes des cellules souches de la cornée à celui des cellules souches épidermiques chez la souris montre 3621 gènes communs et 1768 gènes cornéens propres, en plus de Pax6, le gène clé de l'oeil, et de K12, la kératine type de la différenciation terminale de l'épithélium cornéen. La cornée résultant, selon un dogme ancien, d'une induction par le cristallin, j'ai effectué des expériences chez l'embryon de poulet de 2 jours afin de le vérifier. L'ablation chirurgicale de la placode cristallinienne ayant mis en évidence sa régénération, j'ai prévenu sa formation en électroporant Gremlin, un inhibiteur de BMP4, requis lors la spécification du cristallin par la vésicule optique. L'obtention d'oeil sans cristallin mais avec un épithélium cornéen exprimant K12 montre que le programme cornéen s'effectue par défaut lorsque le programme cristallinien est interrompu. Cet arrêt se produit normalement à la périphérie de la placode cristallinienne qui s'invagine, lors de la migration des cellules des crêtes neurales, productrices de Gremlin. Les précurseurs de l'épithélium cornéen sont donc communs avec ceux du cristallin, qui sont connus pour se ségréger chez l'embryon lors de la formation du domaine préplacodal au stade neurula.

La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.

Les mutations MKS1 sont impliquées dans un groupe de ciliopathies récessives létales, telles que le syndrome de Meckel-Gruber (MKS) et le syndrome de Joubert (JBT), caractérisées par une dysplasie rénale kystique, des anomalies du système nerveux central (encéphalocèle occipitale), une polydactylie, une dysgénésie biliaire et une fibrose hépatique. MKS1 a été localisée dans la zone de transition du cil dans de nombreux types cellulaires où elle joue un rôle essentiel pour la structure et la fonction des cils, en particulier la régulation de plusieurs voies de signalisation telles que Wnt et Shh.Dans le présent travail, nous avons identifié la fonction pré-ciliaire de MKS1 dans des cellules épithéliales. Nous avons montré que la localisation subcellulaire de MKS1 varie au cours de la maturation de l’épithelium, passant du cytosol où MKS1 co-localise avec le réseau de kératine, aux jonctions cellulaires, où elle co-colocalise avec les caténines. De plus, la translocation de MKS1 des jonctions au cytosol s'est avérée être mécano-sensible, suggérant que MKS1 participe à l'homéostasie épithéliale en stabilisant les jonctions cellulaires, via la transduction des signaux mécaniques liés à la compaction de l’épithelium.L’analyse fonctionnelle a démontré que le « knockdown » de MKS1 désorganise le réseau de kératine, et déstabilise les jonctions adhérentes des cellules épithéliales en culture, avec une diminution de la β-caténine jonctionnelle et une libération de l’E-cadhérine, l’α-caténine et la vinculine dans le cytosol. De plus, la déplétion de MKS1 entraîne une diminution notable du réseau apical d’actine, ainsi que la désorganisation de la structure épithéliale et une transition partielle vers un état mésenchymateux. Ces résultats illustrent une fonction indépendante du cil de MKS1 dans l’homéostasie épithéliale, et apporte de nouvelles hypothèses quant à son rôle et celui des filaments intermédiaires dans les processus d’organogenèse des épitheliums, en particulier la tubulogenèse, qui repose à la fois sur l’équilibre de la transition épithelium/mesenchyme et la mécanotransduction des sollicitations mécaniques durant l’embryogenèseDans le but de caractériser les partenaires de MKS1, des expériences de Co-IP et d’analyses protéomiques ont permis d’identifier l’epiplakine comme un partenaire possible de MKS1. L'Epiplakine est un cytolinker capable de lier la kératine à la membrane et à l'actine ; l’interaction de MKS1 avec l’epiplakine pourrait ainsi rendre compte de la stabilisation à la fois du réseau de kératine et des jonctions cellulaires. Des analyses complémentaires de protéomique et des études fonctionnelles devront compléter ces résultats préliminaires.Finalement, ces travaux ont également permis de révéler le rôle de MKS1 dans la stabilisation des jonctions communicantes ; la déplétion de MKS1 conduisant à une diminution de la CX43 jonctionnelle et à une altération de la fonction de communication intercellulaire dans les cellules épithéliales en culture. Ces travaux, qui constituent la première mention d’une altération possible des jonctions communicantes dans ce type de maladies, devront être approfondis pour caractériser leur impact dans les processus de tubulogenèse.En conclusion, ce travail qui a permis de révéler un rôle pré-ciliaire de MKS1 dans l'homéostasie épithéliale, apporte de nouvelles hypothèses pour l’étiologie de ces maladies, jusqu’alors considérées comme essentiellement consécutives à des défauts de transduction de la signalisation ciliaire. Il propose également de nouveaux mécanismes pour rendre compte des anomalies du développement hépatique, telles que la dysgénésie des voies biliaires, et plus largement des processus de tubulogenèse impliqués dans le développement de nombreux organes. / MKS1 mutations are involved in a group of lethal recessive ciliopathies, such as Meckel-Gruber syndrome (MKS) and Joubert's syndrome (JBT), characterized by cystic renal dysplasia, central nervous system abnormalities (occipital encephalocele) , polydactyly, biliary dysgenesis and hepatic fibrosis. MKS1 has been located in the transition zone of the cilia in many cell types where it plays an essential role in the cilia structure and function, in particular in the regulation of signaling pathways such as Wnt and Shh.In the present work, we have identified the preciliary function of MKS1 in epithelial cells. We have shown that the subcellular localization of MKS1 varies during the maturation of the epithelium, from the cytosol where MKS1 co-localizes with the keratin network, to the cell junctions, where it co-localizes with the catenins. In addition, the MKS1 translocation to cytosol junctions proved to be mechano-sensitive, suggesting that MKS1 participates in epithelial homeostasis by stabilizing cell junctions, via the transduction of mechanical signals related to epithelial compaction.Functional analysis has shown that the knockdown of MKS1 disrupts the keratin network, and destabilizes the adherent junctions of epithelial cells in culture, with a decrease in the junctional β-catenin and a release of E-cadherin, the α-catenin and vinculin in the cytosol. In addition, the depletion of MKS1 results in a significant decrease in the apical actin network, as well as disorganization of the epithelial structure and a partial transition to a mesenchymal state. These results illustrate a ciliary-independent function of MKS1 in epithelial homeostasis, and provides new hypotheses regarding its role and that of intermediate filaments in epithelial organogenesis processes, in particular tubulogenesis, which is based both on the equilibrium of the epithelium / mesenchyme transition and the mechanotransduction of mechanical stresses during embryogenesisIn order to characterize MKS1 partners, Co-IP experiments and proteomic analyzes have identified epiplakin as a possible MKS1 partner. Epiplakin is a cytolinker capable of binding keratin to membrane and actin; the interaction of MKS1 with epiplakin could thus account for the stabilization of both the keratin network and cell junctions. Additional proteomic analyzes and functional studies will complement these preliminary results.Finally, this work has also revealed the role of MKS1 in the stabilization of gap junctions; the depletion of MKS1 leading to a decrease in the junctional CX43 and an alteration of the intercellular communication function in the epithelial cells in culture. This work, which constitutes the first mention of a possible alteration of gap junctions in this type of disease, will have to be further developed to characterize their impact on tubulogenesis processes.In conclusion, this work which revealed a pre-ciliary role of MKS1 in epithelial homeostasis, provides new hypotheses for the etiology of ciliopathies, previously considered as essentially consecutive to signal transduction defects. It also proposes new mechanisms to account for abnormalities of hepatic development, such as bile ducts dysgenesis, and more broadly tubulogenesis processes involved in the development of many organs.

Kératines (K), protéines constitutives des filaments intermédiaires (FI) de l'épithélium, englobent une vingtaine de protéines du cytosquelette, exprimées différenti-ellement selon la différenciation et regroupées en deux catégories: type I (K9-20) et type II (Kl-8). Dans le foie, les FI des hépatocytes sont composés uniquement des K8 et Kl8, marqueurs typiques de l'épithélium simple. En raison de son métabolisme unique et de sa relation avec le tracrus gastro-intestinal, le foie constitue une cible majeure de la toxicité induite par les médicaments, les xénobiotiques et le stress oxydatif. La présente étude révèle que les hépatocytes de souris ainsi que les hépatomes H4IIE dépourvues de K8 (K8-null et shK8b respectivement) sont plus résistants que leurs homologues contenant la K8 (WT et H4ev respectivement), suite à un excès de H2O2. Les cellules meurent via les mitochondries en lien avec une activation et une localisation altérées de la PKCô dans les cellules shK8b. Même si le H2O2 modifie différentiellement les niveaux de glutathione (GSH) et des espèces reactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules H4ev versus shK8b, la réponse de mort est largement indépendante du niveau de GSH. En outre, nos résultats montrent que la différence dans le niveau de GSH provient d'une altération dans le métabolisme du glucose dans les cellules shK8b. Une stimulation du récepteur de l'insuline à la surface cellulaire déclenche préférentiellement une signalisation dépendante du glucose associée à l'activation de la voie PI3K/AKT, qui à son tour régule différentes activités métaboliques. Comparativement aux cellules H4ev, la stimulation par l'insuline des cellules shK8b présente une cinétique de production du glycogène plus rapide et plus élevée, associée à une signalisation préférentiellement liée à la voie G6P/mTOR/S6K. Par contre dans les hépatocytes, la cinétique différentielle de la production du glycogène en absence de K8 est maintenue, mais a lieu préférentiellement via la voie PI3K/AKT. D'une manière commune, ces altérations dans les voies de signalisation métaboliques amenées par la perte des FI de K8/K18 semblent être liées à une perturbation dans le transport membranaire du glucose à la surface. Ensemble, ces résultats fournissent la première évidence directe de la régulation par les FI de K8/K18 du métabolisme du glucose dépendent de l'insuline et de la mort cellulaire induite par les ROS dans les cellules hépatiques.

Mon projet de recherche vise à évaluer l'effet à long terme de l'exposition à la fumée de cigarette (FC) sur la croissance des cellules épithéliales gingivales et l'expression de plusieurs kératines (K). Les cellules exposées à la FC montrent une activité métabolique et une prolifération cellulaire élevées par rapport aux cellules non exposées. Cependant, une exposition prolongée à la FC réduit le rapport Bax/Bcl-2 ce qui suggère une résistance des cellules exposées à la mort cellulaire. Nos analyses montrent aussi que l'exposition à la FC diminue le niveau d'ARNm des kératines K5, K1, K10, K16. Cependant les K14 et K6 montrent une augmentation après une certaine période d'exposition. Fait intéressant, l'analyse de la production de protéines dont les K5, K1 et K16 montre une expression stable de ces protéines après l'exposition à la FC. En revanche, les K14 et K6 sont significativement augmentées, tandis que la K10 a diminué. Ces observations peuvent expliquer l’hyperplasie observée au niveau des tissus gingivaux des fumeurs, et la fréquence des maladies parodontales. / This research project is aimed to evaluate the effect of long-term exposure to cigarette smoke (CS) on the gingival epithelial cells growth and the expression of different keratins (K). The CS-exposed cells are showing high metabolic activity and cell proliferation as compared to non-exposed cells, suggesting an increase in the cells growth. Importantly, the prolonged exposure to CS was found to decrease Bax/Bcl-2 ratio that indicates the death resistance. Moreover, the gene expression analysis showed that the exposure to CS decreases the mRNA level of K5, K1, K10, and K16; excepting K14 and K6 were showing an increase after a certain exposure period. Interestingly, protein production analysis of K5, K1, and K16 are showing a stable expression after the exposure to CS. In contrast, K14 and K6 are significantly increased, while K10 decreased after CS exposure. These observations suggest an abnormal growth of the gingiva that may lead to the periodontal diseases.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Les cellules souches sont à la base de la régénération des tissus adultes et du maintien de leur homéostasie. Afin d'étudier le processus de différenciation des cellules souches cutanées et d'approfondir nos connaissances sur les conditions qui contrôlent leur différenciation en épiderme et/ou en follicules pileux in vitro différents substituts cutanés ont été mis au point par génie tissulaire. D'une part, la portion dermique des peaux reconstruites a été produite par la superposion de feuillets de matrice extracellulaire produits par des fibroblastes humains ou murins cultivés en présence d'acide ascorbique. D'autre part, des kératinocytes (humains ou murins) ou des follicules pileux immatures (murins) ont été implantés sur les dermes reconstruits. Les propriétés histologiques et immunohistochimiques des tissus ont été évaluées après leur maturation in vitro ou sur l'animal. Nos résultats ont révélé que les interactions mésenchyme-épithéliales créées dans la peau reconstruite par génie tissulaire influencent significativement la voie de différenciation qu'empruntent les kératinocytes engendrés par les cellules souches et qu' il est possible, en recréant les conditions adéquates, de reconstruire des substituts cutanées aux propriétés histologiques similaires à la peau native ainsi que des peaux reconstruites capables de soutenir la formation de follicules pileux après la greffe. Des études in situ ont également été menées sur les cellules souches de la vibrisse de la souris. Nous avons observé que les kératinocytes présentant un cycle cellulaire long forment deux populations distinctes dans la région du renflement: une est en contact avec la membrane basilaire et l'autre ne l'est pas (appelée Bs1). Chacune de ces populations possède un aspect histologique distinct et présente une organisation, du réseau de kératine qui lui est spécifique et qui est associée à l'expression de kératines particulières. L'étude des vibrisses des souris dont le gène de la kératine 17 (K 17) a été invalidé a révélé que la K 1 7 est essentielle à la formation des vibrisses et à l'intégrité ultrastructurale des cellules Bs 1. En conclusion, mes travaux apportent de nouvelles données sur les conditions qui régissent la différenciation des cellules souches cutanées et sur les caractéristiques intrinsèques des cellules souches de la vibrisse.