L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie orpheline dermatologique qui a une prévalence mondiale de 1/50 000 à 1/30 000. Elle est caractérisée par des mutations transmises de manière autosomale dominante dans les gènes de la kératine 5 (KRT5) et 14 (KRT14), menant à une agrégation des filaments intermédiaires. Phénotypiquement, il y a présence d’ampoules causées par un décollement de l’épiderme. Jusqu’à présent, aucune thérapie efficace n’est disponible. Dans cette étude, des essais cellulaires évaluant le potentiel thérapeutique de deux chaperonnes chimiques, le triméthylamine N-oxyde (TMAO) et le sodium 4-phénylbutyrate (4-PBA), ont été réalisés. Pour ce faire, trois lignées immortalisées de kératinocytes de patients EBS ayant une mutation dans KRT14 et une lignée contrôle ont été utilisées pour déterminer la capacité des molécules à réduire le nombre de cellules ayant des agrégats. Les résultats ont montré un effet bénéfique significatif du TMAO seulement, et ce dans deux lignées uniquement. Ainsi, le TMAO se qualifie comme une approche thérapeutique potentielle.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2017-2018 / L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique rare causée par des mutations dans le gène COL7A1, codant pour le collagène de type VII, qui est sécrété par les kératinocytes et les fibroblastes cutanés. Le collagène de type VII forme les fibrilles d'ancrage responsables de l'adhésion à la jonction dermo-épidermique et son absence provoque des décollements de l'épiderme. Il n'y a aucun traitement curatif pour l'EBDR. L’objectif de ce projet est de développer un traitement pour l'EBDR par thérapie génique, en utilisant la peau reconstruite par génie tissulaire produite à partir de fibroblastes et de kératinocytes humains modifiés génétiquement pour exprimer le gène COL7A1. Une méthode de transduction de fibroblastes et de kératinocytes a été optimisée. L'efficacité des facilitateurs EF-C et polybrène à augmenter la transduction des vecteurs rétroviraux pseudotypés avec les enveloppes Ampho, BaeV, Galv ou RD114 a été comparée. Les conditions optimisées ont été utilisées pour délivrer le gène COL7A1 portant une étiquette hémaglutinine dans les cellules utilisées pour reconstruire la peau in vitro par la méthode d'auto-assemblage. Les résultats montrent que le peptide EF-C a augmenté la transduction des fibroblastes et des kératinocytes en comparaison au polybrène. De plus, l’évaluation de l’efficacité de formation des colonies a indiqué que les conditions de transduction optimisées ont permis de préserver des kératinocytes formant des clones typiquement associés aux cellules souches. Lorsque les cellules transduites par le vecteur ont été utilisées pour produire des peaux reconstruites, le collagène de type VII synthétisé à partir du gène inséré s'est localisé à la jonction dermo-épidermique comme le collagène natif. Ces résultats indiquent que le transfert de gènes pour produire la peau reconstruite est une technologie prometteuse pour le traitement de l'EBDR. La greffe de ces tissus autologues sur les patients pourrait offrir une méthode efficace et sécuritaire pour traiter cette maladie. / Recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is a rare genetic disease caused by mutations in the COL7A1 gene, which encodes type VII collagen. Secreted by keratinocytes and fibroblasts, the type VII collagen forms the anchoring fibrils that ensure dermal-epidermal junction cohesion in the skin. Its absence leads to epidermal detachment. There is no cure for RDEB. The objective of this project is to develop a treatment for RDEB, integrating gene therapy and tissue-engineered skin substitutes produced with human fibroblasts and keratinocytes genetically modified to express the COL7A1 gene. A method to transduce fibroblasts and keratinocytes was optimized. The efficacy of the enhancers EF-C and polybrene to increase the transduction efficiency of pseudotyped retroviral vectors with the Ampho, Baev, Galv or RD114 envelopes was compared. The optimized conditions were used to deliver the COL7A1 gene tagged with hemagglutinin (HA) in the cells used to reconstruct in vitro tissue-engineered skin substitute by the self-assembly method. Results showed that the EF-C-peptide increased transduction of fibroblasts and keratinocytes in comparison to polybrene. In addition, the colony forming efficiency assay indicated that optimized conditions of transduction allowed to preserve keratinocyte clones typically formed by stem cells. When transduced cells were used to produce tissue-engineered skin substitute, type VII collagen synthesized from the newly inserted COL7A1 tagged HA gene was located at the dermal-epidermal junction like in native skin. These results indicate that the combination of gene therapy and tissue engineering is a promising technology for the treatment of RDEB. The transplantation of autologous tissue-engineered skin substitutes genetically corrected with normal COL7A1 gene in RDEB patients could offer a safe and effective method to treat this disease.

L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive est une maladie génétique rare causée par des mutations dans COL7A1 codant pour le collagène de type VII. Cette protéine est produite par les kératinocytes de l’épiderme et les fibroblastes du derme et permet la formation des fibrilles d’ancrages dont le rôle est l’adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les patients atteints de l'EBDR souffrent de décollements de la peau et des muqueuses et aucun traitement ne permet de guérir cette maladie. Le but de ce projet est de construire un vecteur viral sécuritaire contenant l'ADNc de COL7A1 et de générer un clone de cellules productrices de virus à haut titre permettant de transduire assez de kératinocytes souches pour produire des peaux reconstruites et traiter les patients atteints de l'EBDR. Divers vecteurs rétroviraux "self-inactivated" exprimant l'ADNc de gfp ou de COL7A1 ont été générés. Les vecteurs GFP ont permis de déterminer que le remplacement de la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR du transgène, l'insertion de la séquence de polyadénylation du SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de bGH en aval du LTR 3', génèrent les titres viraux les plus élevés. L'ADNc de COL7A1 a été introduit dans un rétrovirus SIN optimisé puis transfecté dans une lignée d’encapsidation exprimant l’enveloppe Amphotropique 4070A. Un clone de cellules productrices produisant 9,8 x 105 particules virales par mL a été isolé. Le virus produit par ce clone est capable de transduire les kératinocytes et fibroblastes de patients atteints de l'EBDR à un taux de transduction de 37 % et 24 % respectivement. En somme, un clone de cellules productrices d’un vecteur rétroviral sécuritaire portant COL7A1 a été généré et a le potentiel d’être utilisé pour la thérapie génique de l’EBDR. / Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is a rare genetic disorder caused by mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. This protein is produced by the epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts and allows the formation of anchor fibrils whose role is the adhesion of the epidermis to the underlying dermis. Patients with EBDR suffer from skin and mucosal detachments and no treatment can cure this disease. The goal of this project is to construct a safe viral vector containing COL7A1 cDNA and to generate a high-titer virus-producing cell clone in order to transduce enough keratinocytes stem cells to produce reconstructed skins to treat patients with EBDR. Various self-inactivated retroviral vectors expressing gfp or COL7A1 cDNA have been generated. The GFP vectors allowed us to determine that the replacement of the U3 region of the 5' LTR by the CMV enhancer and promoter, the addition of the WPRE sequence to the 3 'UTR of the transgene, the insertion of the SV40 polyadenylation sequence into the R region of 3' LTR and the addition of the polyadenylation sequence of the bGH downstream of the 3' LTR generate the highest viral titers. COL7A1 cDNA was introduced into an optimized SIN retrovirus and transfected into a packaging cell line expressing the Amphotropic envelope 4070A. A clone of packaging cells producing 9.8 x 105 viral particles per mL was isolated. The virus produced by this clone is capable of transducing the keratinocytes and fibroblasts of patients with EBDR at a transduction rate of 37 % and 20 % respectively. In sum, a clone of cells producing a safe COL7A1 retroviral vector has been generated and has the potential of being used for gene therapy of EBDR.

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) fait partie d’un regroupement de maladies héréditaires dont le tissu cible est la peau. Cette maladie dermatologique est causée par une mutation dans les gènes KRT5 ou KRT14, laquelle entraîne un problème au niveau de la formation des filaments intermédiaires de la kératine qui composent la peau. Un mésappariement au niveau des kératines 5 et 14 est responsable de l’apparition des symptômes de la maladie incluant la formation de cloques suite au trauma mécanique que subit la peau. Ces cloques entraînent d’importantes douleurs chez le patient, et de l’inflammation et de l’irritation. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible pour soulager les patients atteints de la maladie. Depuis quelques années, les chercheurs utilisent des technologies pour modifier directement l’ADN des patients afin de réparer la mutation responsable de l’apparition des symptômes. Des technologies d’édition du génome telles que CRISPR/Cas9 constituent donc une avenue prometteuse pour le traitement de maladies héréditaires monogéniques comme l’EBS. Cette technologie permet de cibler un endroit précis dans le génome par la combinaison d’un ARN guide simple brin et d’une protéine Cas9. La réparation de l’ADN se fait par l’induction d’une coupure double brin de l’ADN par la protéine Cas9 et sa réparation par un fragment d’ADN donneur double ou simple brin. Ce projet a pour objectif principal de corriger les mutations causant l’EBS chez deux patients possédant des mutations hétérozygotes. Plus spécifiquement, ce projet de maîtrise a pour objectif d’optimiser la méthode permettant l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans un contexte d’EBS. La technologie CRISPR/Cas9 a été utilisée sur des cellules HEK293T, permettant de démontrer que la Cas9 est en mesure d’induire une coupure double brin de l’ADN au site ciblé dans l’ADN. Ensuite, il a été démontré que la coupure de la Cas9 jumelée à l’utilisation d’un ADN double ou simple brin permet de réparer la coupure en réalisant de la recombinaison homologue. Le séquençage a permis de confirmer ces résultats. À ce jour, les résultats dans les cellules HEK293T se sont montrés concluants et ont permis d’initier les travaux dans les fibroblastes de patients.

L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est caractérisée par un décollement intra-épidermique au niveau de la couche basale de l’épiderme aboutissant à la formation de bulles et de cloques cutanées. L’EBS est causée par des mutations au niveau des gènes qui codent pour la kératine 5 (K5) ou la kératine (K14), qui sont transmises majoritairement selon un mode autosomique dominant. L’EBS affecte environ 1/50 000 à 1/30 000 personnes dans le monde et elle est considérée comme une maladie orpheline. Dans cette étude, les kératinocytes ont été isolés de biopsies de la peau de patients atteints d’EBS ayant des mutations dans le gène KRT14 et de témoins non atteints. Des essais thérapeutiques utilisant l’interféron gamma (IFN-γ) ont été réalisés afin de stimuler la production de la K15. Les résultats ont révélé que l’IFN-γ réduit l’expression et la production de la K15 contrairement à ce que suggérait la littérature. Cette discordance pourrait s’expliquer par un effet « régulateur » de l’IFN-γ sur la K15 lorsque les cellules seraient activées. Cette hypothèse a été validée par l’augmentation de l’expression de la KRT16 qui est considérée comme un marqueur de préactivation des kératinocytes. Ainsi, l’IFN-γ ne semble pas être une cible thérapeutique potentielle pour l’EBS causée par une mutation de KTR14 (R125S).