As raias são peixes peçonhentos e estão frequentemente associadas a acidentes em seres humanos, principalmente na região Norte do Brasil, favorecidos pelo hábito desses peixes de permanecerem no fundo de águas rasas e pela contínua utilização humana dos rios. Os ferrões das raias causam lesões dolorosas, edema, necrose, e o muco que recobre toda a extensão do corpo desses peixes pode aumentar a gravidade desses ferimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida pelo muco de Paratrygon aiereba nativo ou irradiado por raios gama de 60Co em modelos animais. Foram realizados ensaios imunoenzimáticos e Western blotting para verificar a resposta humoral e reatividade cruzada dos soros provenientes de camundongos Swiss e coelhos New Zealand previamente imunizados contra o veneno, muco nativo ou irradiado. A indução da produção de anticorpos in vitro, as subclasses de IgG e a quantificação de citocinas foram analisados. Além de realizados ensaios de soroneutralização da atividade edematogênica in vitro e in vivo e de viabilidade celular. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância. O protocolo de imunização possibilitou a obtenção de soros com títulos satisfatórios de anticorpos policlonais. O muco e veneno de P. aiereba são imunogênicos e apresentam reatividade antigênica. O muco nativo ou irradiado induziu a produção de anticorpos IgG e esses reconheceram antígenos presentes no muco de outras espécies de raias. Células esplênicas de animais imunizados contra o muco irradiado produziram IFN-γ, TNF- α e IL-10 e também foi observada a produção sérica de TNF-α (grupo imunizado contra o muco irradiado) e de IL-6 e IL-17 (grupo imunizado contra o muco nativo). O soro anti-muco irradiado reduziu a atividade edematogênica in vitro, ao contrária da in vivo que não foi neutralizada. Os resultados corroboram o uso da radiação ionizante, com produção de anticorpos altamente responsivos e melhor resposta imune, além de comprovar que o muco de Paratrygon aiereba foi capaz de estimular resposta imune adaptativa celular e humoral. / Freshwater stingrays are venomous animals, frequently associated with accidents in northern Brazil where the shallow waters and the human use of the rivers favour close proximity between the fish and potential victims. Ray stings induce painful lesions, edema, necrosis, and the mucus that covers the body of these fishes may increase the severity of the wounds. The aim of this work was to evaluate the immune response induced by native or 60Co Paratrygon aiereba mucus in animal models. Enzyme linked immunosorbent assays and western blots were performed to compare humoral immune response as well as cross reactivity using antibodies raised in mice or rabbits against venom or mucus, the latter either in its native or irradiated form. Antibody production in vitro, immunoglobulins subclasses and cytokines production were evaluated. Immunization resulted in good levels of antibodies. Interestingly, both the mucus and the venom share many cross reactive components. Furthermore, antibodies raised against native mucus or its irradiated counterpart were cross-reactive against the mucus of other stingray species. Splenic cells from mice immunized with irradiated mucus secreted IFN-γ, TNF-α and IL-10. The serum raised against irradiated mucus reduced edematogenic activity in vitro, but not in vivo, when the venom and the serum are injected separately. Our results corroborate the potential of ionizing radiation as a detoxifying agent for immunogens, with production of high antibody titers and, that the highly abundant mucus of freshwater stingrays contains basically the same repertoire of antigens as the venom, inducing the synthesis of high levels of neutralizing antibodies.

As raias são peixes peçonhentos e estão frequentemente associadas a acidentes em seres humanos, principalmente na região Norte do Brasil, favorecidos pelo hábito desses peixes de permanecerem no fundo de águas rasas e pela contínua utilização humana dos rios. Os ferrões das raias causam lesões dolorosas, edema, necrose, e o muco que recobre toda a extensão do corpo desses peixes pode aumentar a gravidade desses ferimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida pelo muco de Paratrygon aiereba nativo ou irradiado por raios gama de 60Co em modelos animais. Foram realizados ensaios imunoenzimáticos e Western blotting para verificar a resposta humoral e reatividade cruzada dos soros provenientes de camundongos Swiss e coelhos New Zealand previamente imunizados contra o veneno, muco nativo ou irradiado. A indução da produção de anticorpos in vitro, as subclasses de IgG e a quantificação de citocinas foram analisados. Além de realizados ensaios de soroneutralização da atividade edematogênica in vitro e in vivo e de viabilidade celular. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância. O protocolo de imunização possibilitou a obtenção de soros com títulos satisfatórios de anticorpos policlonais. O muco e veneno de P. aiereba são imunogênicos e apresentam reatividade antigênica. O muco nativo ou irradiado induziu a produção de anticorpos IgG e esses reconheceram antígenos presentes no muco de outras espécies de raias. Células esplênicas de animais imunizados contra o muco irradiado produziram IFN-γ, TNF- α e IL-10 e também foi observada a produção sérica de TNF-α (grupo imunizado contra o muco irradiado) e de IL-6 e IL-17 (grupo imunizado contra o muco nativo). O soro anti-muco irradiado reduziu a atividade edematogênica in vitro, ao contrária da in vivo que não foi neutralizada. Os resultados corroboram o uso da radiação ionizante, com produção de anticorpos altamente responsivos e melhor resposta imune, além de comprovar que o muco de Paratrygon aiereba foi capaz de estimular resposta imune adaptativa celular e humoral. / Freshwater stingrays are venomous animals, frequently associated with accidents in northern Brazil where the shallow waters and the human use of the rivers favour close proximity between the fish and potential victims. Ray stings induce painful lesions, edema, necrosis, and the mucus that covers the body of these fishes may increase the severity of the wounds. The aim of this work was to evaluate the immune response induced by native or 60Co Paratrygon aiereba mucus in animal models. Enzyme linked immunosorbent assays and western blots were performed to compare humoral immune response as well as cross reactivity using antibodies raised in mice or rabbits against venom or mucus, the latter either in its native or irradiated form. Antibody production in vitro, immunoglobulins subclasses and cytokines production were evaluated. Immunization resulted in good levels of antibodies. Interestingly, both the mucus and the venom share many cross reactive components. Furthermore, antibodies raised against native mucus or its irradiated counterpart were cross-reactive against the mucus of other stingray species. Splenic cells from mice immunized with irradiated mucus secreted IFN-γ, TNF-α and IL-10. The serum raised against irradiated mucus reduced edematogenic activity in vitro, but not in vivo, when the venom and the serum are injected separately. Our results corroborate the potential of ionizing radiation as a detoxifying agent for immunogens, with production of high antibody titers and, that the highly abundant mucus of freshwater stingrays contains basically the same repertoire of antigens as the venom, inducing the synthesis of high levels of neutralizing antibodies.

O veneno do T.nattereri induz uma resposta de memória com a diferenciação de células B B220neg, indicativo de células produtoras de anticorpos de vida longa (ASC). Para avaliar o efeito do veneno na diferenciação de ASCs, camundongos BALB/c foram imunizados e sacrificados nos dias 21, 28, 48, 74 e 120 para avaliação de anticorpos plasmáticos e células B no peritônio, baço e medula óssea. O veneno induziu intensa esplenomegalia, formação de centros germinativos e persistentes níveis de anticorpos específicos IgG1, IgG2a e IgE anafilática. Células B1a e ASC apareceram rapidamente e a população de ASC CD138pos foi dividida em três subtipos (B220highCD43high, B220lowCD43low, e B220negCD43high) que persistiram em diferentes níveis em todos compartimentos. Finalmente, por métodos de neutralização nós sugerimos um papel importante da IL-5 e IL-17 A no desenvolvimento de ASC B220neg e na população B1a e mais ainda, a produção de TNF-a, IL-1b, IL-6, KC bem como a retenção do veneno nas células dendríticas foliculares parece promover os mecanismos para manutenção das ASCs. / T. nattereri fish venom induces a memory immune response with the differentiation of B cells B220neg, an indicative of long-lived antibody-secreting cells - ASC. To assess the effect of the venom on differentiation of ASCs, BALB/c mice were immunized with venom and sacrificed at days 21, 28, 48, 74 and 120 to evaluate plasmatic antibodies and B cell subtypes in peritoneum, spleen and bone marrow. The venom promoted splenomegaly, germinal centers formation and persistent levels of specific antibodies IgG1, IgG2a and anaphylactic IgE. B1a cells and ASC emerged rapidly and CD138pos ASCs can be divided into three subsets (B220high CD43high, B220low CD43low, and B220neg CD43high) that persist at different levels in all compartments. Finally, by neutralization methods we suggested an important role for IL-5 and IL-17A on development of B220neg ASCs and B1a population and moreover the production of TNF-a, IL-1b, IL-6, KC as well as the venom retained in follicular dendritic cells seem to provide mechanisms to explain the maintenance of ASCs.

O veneno do T.nattereri induz uma resposta de memória com a diferenciação de células B B220neg, indicativo de células produtoras de anticorpos de vida longa (ASC). Para avaliar o efeito do veneno na diferenciação de ASCs, camundongos BALB/c foram imunizados e sacrificados nos dias 21, 28, 48, 74 e 120 para avaliação de anticorpos plasmáticos e células B no peritônio, baço e medula óssea. O veneno induziu intensa esplenomegalia, formação de centros germinativos e persistentes níveis de anticorpos específicos IgG1, IgG2a e IgE anafilática. Células B1a e ASC apareceram rapidamente e a população de ASC CD138pos foi dividida em três subtipos (B220highCD43high, B220lowCD43low, e B220negCD43high) que persistiram em diferentes níveis em todos compartimentos. Finalmente, por métodos de neutralização nós sugerimos um papel importante da IL-5 e IL-17 A no desenvolvimento de ASC B220neg e na população B1a e mais ainda, a produção de TNF-a, IL-1b, IL-6, KC bem como a retenção do veneno nas células dendríticas foliculares parece promover os mecanismos para manutenção das ASCs. / T. nattereri fish venom induces a memory immune response with the differentiation of B cells B220neg, an indicative of long-lived antibody-secreting cells - ASC. To assess the effect of the venom on differentiation of ASCs, BALB/c mice were immunized with venom and sacrificed at days 21, 28, 48, 74 and 120 to evaluate plasmatic antibodies and B cell subtypes in peritoneum, spleen and bone marrow. The venom promoted splenomegaly, germinal centers formation and persistent levels of specific antibodies IgG1, IgG2a and anaphylactic IgE. B1a cells and ASC emerged rapidly and CD138pos ASCs can be divided into three subsets (B220high CD43high, B220low CD43low, and B220neg CD43high) that persist at different levels in all compartments. Finally, by neutralization methods we suggested an important role for IL-5 and IL-17A on development of B220neg ASCs and B1a population and moreover the production of TNF-a, IL-1b, IL-6, KC as well as the venom retained in follicular dendritic cells seem to provide mechanisms to explain the maintenance of ASCs.