A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.

Bactérias do gênero Azospirillum possuem a capacidade de promover o crescimento vegetal através de mecanismos que não estão claramente elucidados. Contudo, essa característica é muito estudada, tendo em vista a possibilidade de utilizar esses microrganismos na agricultura em detrimento do uso indiscriminado de fertilizantes industriais, que poluem o meio ambiente. O solo é um ambiente altamente variável quanto à disponibilidade de nutrientes e quanto a fatores físico-químicos, por isso, bactérias que ocupam esse nicho possuem um aparato genético capaz de prover uma adaptação plena a este ambiente. A bactéria A. amazonense tem um genoma altamente complexo e pouco estudado. O presente trabalho isolou genes envolvidos na resposta de A. amazonense ao estresse por limitação nutricional de nitrogênio, elemento crucial para a sobrevivência, já que compõe diferentes moléculas biológicas. Um dos objetivos deste trabalho foi o isolamento de genes que codificam proteínas PII em A. amazonense, que estão envolvidas na regulação do metabolismo do nitrogênio. A. amazonense apresenta dois genes parálogos que codificam para proteínas PII, glnB e glnK. Demonstramos que ambos são regulados pela disponibilidade de nitrogênio no meio. A região promotora de glnK possui elementos típicos de genes regulados pelo sistema Ntr: quatro sítios de ligação ao fator de transcrição NtrC e um promotor dependente de σ54. Foi identificada uma seqüência que corresponde a um promotor dependente de σ70 putativo sobreposto a um sítio de ligação a NtrC. O segundo objetivo foi isolar genes regulados pela disponibilidade de nitrogênio através da técnica Micro-RDA. Essa técnica é muito sensível, no entanto há poucos relatos da sua utilização em bactérias, visto provavelmente as dificuldades técnicas do trabalho com o mRNA bacteriano. Através desse procedimento, foram isolados oito genes envolvidos na resposta à limitação de nitrogênio. Sete deles apresentam homologia com genes de bactérias da classe Proteobacteria: dnaK e rpoH (genes que codificam proteínas envolvidas em choque térmico), relA (envolvido na síntese de ppGpp, um mediador da resposta “estringente”), um gene que codifica para uma diguanilato ciclase/fosfodiesterase (envolvido na síntese de c-di-GMP, envolvido na formação de biofilmes), um gene que codifica uma subunidade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons, glnA (glutamina sintetase) e gltB (glutamato sintase). A variedade funcional desses genes ilustra o grau de complexidade da resposta de A. amazonense à limitação nutricional de nitrogênio. / Bacteria belonging to the Azospirillum genus are capable of promoting plant growth, but the mechanisms implicated in this feature are not clearly elucidated. This ability has been investigated by several research groups with the main objective of substitute the use of industrialized fertilizers by bacteria inoculation in the soil. The soil is a very dynamic enviroment, so bacteria have developed many genetic resources to survive in this environment. Azospirillum amazonense has a very complex genome and up till now is poorly analysed. This work has isolated different genes implicated in the nitrogen starvation response of A. amazonense. In the first part of this work we investigated the PII coding genes of A. amazonense, that are involved in nitrogen metabolism regulation. A. amazonense has two PII genes, glnK and glnB. Both are regulated by the nitrogen availability in the medium. The glnK regulatory region has typical elements of Ntr regulated genes: four NtrC UAS sequences (upstream activator binding site) and one σ54-dependent promoter. A putative σ70-dependent promoter, that overlaps the NtrC UAS sequence has been found. In the second part of this work we isolated nitrogen regulated genes by the Micro-RDA technique. This tecnique is very sensitive, but there are few reports of its applicability on bacterial species. This occurs probably due to the bacterial mRNA features. In our work we isolated eight nitrogen regulated genes through the micro-RDA procedure and seven of them have shown similarity to proteobacteria genes. The isolated sequences correspond to: dnaK and rpoH genes (implicated in heat shock response), relA gene (involved in stringent response), a diguanylate cyclase/phosphodiesterase gene (implicated in biofilm formation), a complex I subunit gene (electrons transport chain), glnA gene (glutamine syntethase) and gltB gene (glutamate synthase). The functional variability of these genes illustrates the complexity of the nitrogen starvation response of A. amazonense.

Os inoculantes contendo microrganismos fixadores de nitrogênio promovem uma grande economia nos sistemas agrícolas em adubação nitrogenada. Para que os produtos inoculantes cheguem ao mercado apresentando os atributos mínimos exigidos pela legislação, faz-se necessário um eficiente controle de qualidade. Neste sentido, este trabalho objetivou comparar as metodologias de análise de inoculantes para leguminosas e desenvolver novas metodologias para serem usadas em controle de qualidade de produtos inoculantes para gramíneas. Para tanto, analisaram-se 12 amostras de inoculantes para leguminosas - sete líquidos e cinco turfosos - e uma amostra de inoculante para gramíneas. Foram comparadas com a legislação as metodologias de diluição seriada por meio de diferentes tipos de diluentes e formas de agitação dos tubos, e diferentes métodos de inoculação em placa. Também foi analisada a sobrevivência dos microrganismos inoculados em semente de soja e milho até 96h após a inoculação, e a utilização de esferas de vidro como alternativa às sementes de soja para ser utilizadas em testes de sobrevivência. O tempo de 10s em vórtex mostrou-se mais vantajoso para ser utilizado na metodologia de diluição seriada. Não houve variação significativa entre os diluentes utilizados, logo, a água destilada mostra-se como alternativa mais prática. A técnica de gota apresentou-se como mais eficiente, devido à ausência de diferença entre os métodos de inoculação. As esferas de vidro e as sementes de soja não representaram diferença real no número de células viáveis recuperadas. Observou-se uma queda no número de bactérias inoculadas em sementes de soja e milho após 6h de armazenamento. Desse modo, as metodologias de diluição seriada, inoculação em placa e análise de sementes inoculadas podem ser otimizadas para o controle de qualidade de inoculantes, tornando os procedimentos laboratoriais mais práticos para o operador. / Inoculants containing N-fixer microorganisms generate huge economy for agricultural systems with nitrogen fertilization. In order to make inoculant products reach the market with the minimum attributes established in legislative determination, it is necessary to perform a good quality control. Therefore, this study aimed to compare methods of analysis of legume inoculants and to develop new methods that can be applied in the quality control of grasses inoculant products. Accordingly, 12 samples of legume inoculants were analyzed – seven liquid and five peaty – along with one sample of grass inoculant. The serial dilution methods were compared to those determined by the legislature, using different types of diluent, tube agitation, and plate inoculation methods. It was also evaluated the survival rate of microorganisms inoculated in soy and corn seeds up to 96h after inoculation, and the use of glass spheres as an alternative for soy seeds in survival tests. Using a vortex for 10s showed the most gainful results for use in serial dilution methods. There was no significant variation between the diluents used, so the distilled water was considered the most convenient alternative. The drop plate technique was the most efficient due to the lack of difference between inoculation methods. The glass spheres and soy seeds did not show actual difference in number of viable cells recovered. There was a reduction in number of bacteria inoculated in soy and corn seeds after 6h of storage. As a result, the methods for serial dilution, plate inoculation, and evaluation of inoculated seeds can be optimized for quality control of inoculants, allowing more convenient laboratory procedures for the operators.

Os inoculantes contendo microrganismos fixadores de nitrogênio promovem uma grande economia nos sistemas agrícolas em adubação nitrogenada. Para que os produtos inoculantes cheguem ao mercado apresentando os atributos mínimos exigidos pela legislação, faz-se necessário um eficiente controle de qualidade. Neste sentido, este trabalho objetivou comparar as metodologias de análise de inoculantes para leguminosas e desenvolver novas metodologias para serem usadas em controle de qualidade de produtos inoculantes para gramíneas. Para tanto, analisaram-se 12 amostras de inoculantes para leguminosas - sete líquidos e cinco turfosos - e uma amostra de inoculante para gramíneas. Foram comparadas com a legislação as metodologias de diluição seriada por meio de diferentes tipos de diluentes e formas de agitação dos tubos, e diferentes métodos de inoculação em placa. Também foi analisada a sobrevivência dos microrganismos inoculados em semente de soja e milho até 96h após a inoculação, e a utilização de esferas de vidro como alternativa às sementes de soja para ser utilizadas em testes de sobrevivência. O tempo de 10s em vórtex mostrou-se mais vantajoso para ser utilizado na metodologia de diluição seriada. Não houve variação significativa entre os diluentes utilizados, logo, a água destilada mostra-se como alternativa mais prática. A técnica de gota apresentou-se como mais eficiente, devido à ausência de diferença entre os métodos de inoculação. As esferas de vidro e as sementes de soja não representaram diferença real no número de células viáveis recuperadas. Observou-se uma queda no número de bactérias inoculadas em sementes de soja e milho após 6h de armazenamento. Desse modo, as metodologias de diluição seriada, inoculação em placa e análise de sementes inoculadas podem ser otimizadas para o controle de qualidade de inoculantes, tornando os procedimentos laboratoriais mais práticos para o operador. / Inoculants containing N-fixer microorganisms generate huge economy for agricultural systems with nitrogen fertilization. In order to make inoculant products reach the market with the minimum attributes established in legislative determination, it is necessary to perform a good quality control. Therefore, this study aimed to compare methods of analysis of legume inoculants and to develop new methods that can be applied in the quality control of grasses inoculant products. Accordingly, 12 samples of legume inoculants were analyzed – seven liquid and five peaty – along with one sample of grass inoculant. The serial dilution methods were compared to those determined by the legislature, using different types of diluent, tube agitation, and plate inoculation methods. It was also evaluated the survival rate of microorganisms inoculated in soy and corn seeds up to 96h after inoculation, and the use of glass spheres as an alternative for soy seeds in survival tests. Using a vortex for 10s showed the most gainful results for use in serial dilution methods. There was no significant variation between the diluents used, so the distilled water was considered the most convenient alternative. The drop plate technique was the most efficient due to the lack of difference between inoculation methods. The glass spheres and soy seeds did not show actual difference in number of viable cells recovered. There was a reduction in number of bacteria inoculated in soy and corn seeds after 6h of storage. As a result, the methods for serial dilution, plate inoculation, and evaluation of inoculated seeds can be optimized for quality control of inoculants, allowing more convenient laboratory procedures for the operators.

A produção da soja em escala comercial tem sido viabilizada técnica e economicamente, entre outros fatores, devido a fixação biológica do N2 por estirpes de Bradyrhizobium que podem suprir a demanda de nitrogênio desta leguminosa. No entanto, a variabilidade existente nas estirpes de Bradyrhizobium spp recomendadas para inoculação da soja tem comprometido o processo simbiótico. Variantes espontâneos isolados a partir das estirpes de B. japonicum (SEMIA 5079 e SEMIA 5080) e B. elkanii (SEMIA 587 e SEMIA 5019) foram avaliados quanto ao desempenho simbiótico (eficiência, nodulação em diferentes hospedeiros e competitividade), indução de clorose foliar em diferentes hospedeiros, morfologia colonial, habilidade de metabolização de carboidratos e tolerância à salinidade em diferentes temperaturas de incubação. Nas etapas de eficiência simbiótica e competitividade foi usada a cultivar de soja BR-16 e na avaliação da nodulação e indução de clorose foliar foram usados os seguintes hospedeiros: soja (Glycine max) (cultivares Clark e Peking), caupi (Vigna unguiculata) e guandu (Cajanus cajan). A caracterização genotípica foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR), com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A 1-R, ERIC e RP01 Os resultados obtidos demonstraram que variantes e estirpes originais diferem quanto a características fenotípicas, e que diferenças nos perfis eletroforéticos de DNA analisados através da amplificação com os oligonucleotídeos iniciadores testados, evidenciaram a variabilidade genética presente entre as estirpes originais e os variantes selecionados. A cultivar de soja Clark, assim como caupi e guandu foram susceptíveis à rizobiotoxina produzida por estirpes e variantes de B. elkanii. Embora não se tenha verificado diferenças na nodulação em diferentes hospedeiros quando variantes ou estirpes de B. japonicum e B. elkanii foram inoculados em soja, caupi e guandu, foi observado uma simbiose eficiente para a soja (cultivares BR 16, Clark e Peking). A partir da variabilidade existente nas estirpes SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 foram selecionados variantes eficientes e competitivos quanto à fixação de N2 em soja.

A produção da soja em escala comercial tem sido viabilizada técnica e economicamente, entre outros fatores, devido a fixação biológica do N2 por estirpes de Bradyrhizobium que podem suprir a demanda de nitrogênio desta leguminosa. No entanto, a variabilidade existente nas estirpes de Bradyrhizobium spp recomendadas para inoculação da soja tem comprometido o processo simbiótico. Variantes espontâneos isolados a partir das estirpes de B. japonicum (SEMIA 5079 e SEMIA 5080) e B. elkanii (SEMIA 587 e SEMIA 5019) foram avaliados quanto ao desempenho simbiótico (eficiência, nodulação em diferentes hospedeiros e competitividade), indução de clorose foliar em diferentes hospedeiros, morfologia colonial, habilidade de metabolização de carboidratos e tolerância à salinidade em diferentes temperaturas de incubação. Nas etapas de eficiência simbiótica e competitividade foi usada a cultivar de soja BR-16 e na avaliação da nodulação e indução de clorose foliar foram usados os seguintes hospedeiros: soja (Glycine max) (cultivares Clark e Peking), caupi (Vigna unguiculata) e guandu (Cajanus cajan). A caracterização genotípica foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR), com os oligonucleotídeos iniciadores BOX A 1-R, ERIC e RP01 Os resultados obtidos demonstraram que variantes e estirpes originais diferem quanto a características fenotípicas, e que diferenças nos perfis eletroforéticos de DNA analisados através da amplificação com os oligonucleotídeos iniciadores testados, evidenciaram a variabilidade genética presente entre as estirpes originais e os variantes selecionados. A cultivar de soja Clark, assim como caupi e guandu foram susceptíveis à rizobiotoxina produzida por estirpes e variantes de B. elkanii. Embora não se tenha verificado diferenças na nodulação em diferentes hospedeiros quando variantes ou estirpes de B. japonicum e B. elkanii foram inoculados em soja, caupi e guandu, foi observado uma simbiose eficiente para a soja (cultivares BR 16, Clark e Peking). A partir da variabilidade existente nas estirpes SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080 foram selecionados variantes eficientes e competitivos quanto à fixação de N2 em soja.