Le récepteur tyrosine kinase FLT3 est impliqué dans le maintien et le renouvellement des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques. Dans environ 30% des cas de leucémies aiguës myéloïdes, il est activé constitutivement par des mutations, dont les plus fréquentes impliquent une duplication de séquence dans le domaine juxtamembranaire (Internal Tandem Duplication, ou ITD). Des inhibiteurs chimiques de FLT3 ont été développés dans le cadre de thérapies anti-cancéreuses, mais leurs essais cliniques se sont révélés assez décevants avec des effets essentiellement transitoires. Par ailleurs, certaines études ont mis en évidence une signalisation intracellulaire spécifique au mutant FLT3-ITD, comme l’activation spécifique de STAT5a. Ces données soulignent la nécessité d’étudier exhaustivement et en détail la signalisation intracellulaire induite par le récepteur FLT3 et ses mutants oncogéniques dans des modèles pertinents, avec l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons surexprimé FLT3 et sa forme mutante ITD dans la lignée murine de progéniteurs myéloïdes FDCP-1/Fms. Ce modèle s’est avéré représentatif des processus observés in vivo en termes de survie, de prolifération et de différenciation monocytaire. Nous l’avons alors utilisé dans une approche protéomique pour identifier des protéines différemment phosphorylées et/ou exprimées entre les deux cas. L’utilisation d’ARN interférant et la surexpression des protéines candidates ou de leurs mutants a permis de révéler l’implication fonctionnelle de plusieurs d’entre elles dans la signalisation FLT3, telles que Hcls1, Ezrin, et PAK1 qui sont toutes des régulateurs du cytosquelette / The FLT3 receptor is involved in stem cells and myeloid progenitors self renewal processes. In about 30% of the acute myeloid leukemia cases, this receptor is mutated and constitutively active, the most common mutation being duplication of sequences in the juxtamembrane domain (Internal Tandem Duplication, ITD). Many chemical inhibitors of FLT3 have been developed for anti-cancer therapies but the clinical trials were a bit disappointing, showing mainly transient effect on blast reduction. Several studies have shown that FLT3-ITD triggers a different signaling from the wild-type receptor, like the specific activation of STAT5a. These data show the necessity of the exhaustive and detailed study of the intracellular signaling induced by FLT3 and its oncogenic mutants, to identify new therapeutic targets. We have overexpressed wild-type and ITD mutant forms of FLT3 in the murine myeloid progenitors cell line FDCP-1/Fms. This model proved it-self representative of the in vivo processes described in the literature in terms of survival, proliferation and monocytic differentiation. Consequently, we have used it for a proteomic approach to identify differentially expressed and/or phosphorylated proteins depending on FLT3 status. Using RAN interference and overexpression of these identified candidate proteins, we have demonstrated the functional involvement of several of them in FLT3 signaling, including Hcls1, Ezrin, and PAK1, which all regulate the cytoskeleton

Adoptive immunotherapy using chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells targeting CD19 has shown remarkable therapeutic efficacy against B cell leukemia and lymphoma, and provided proof of concept for therapeutic potential in other hematologic malignancies. Acute myeloid leukemia (AML) is an entity with an unmet medical need for effective and curative treatments. Therefore, there is a strong desire for development of potentially curative CAR-T cell immunotherapy for AML treatment. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) is a homodimeric transmembrane protein expressed uniformly by AML blasts. FLT3 plays a vital role in the survival of AML blasts and is a key driver of leukemia-genesis in AML cases with internal tandem duplication (FLT3ITD) and tyrosine kinase domain (TKD) mutations. These attributes suggest that FLT3 could be an excellent target for CAR-T cell immunotherapy. Here, we engineered human CD4+ and CD8+ T cells to express FLT3-specific CARs and demonstrate that they confer potent reactivity against AML cell lines and primary AML blasts that express either wild-type FLT3 or FLT3-ITD. Further, we show that FLT3 CAR-T cells exert potent antileukemia activity in xenograft models of AML and induce complete remissions. We also demonstrate that FLT3-expression on FLT3-ITD+ AML cells can be augmented by FLT3 inhibitors, which lead to increased recognition by CARs and improved efficacy of FLT3 CAR-T cells. We confirmed this principle with three different FLT3 inhibitors which are at distinct stages of clinical development i.e. Phase II/III clinical trial (crenolanib, quizartinib) and clinically approved (midostaurin). Further, we observed the strongest anti-leukemia activity of FLT3 CAR-T cells in combination with crenolanib in vivo. FLT3 is known to be expressed by normal hematopoietic stem and progenitor cells. We evaluated FLT3-expression on normal hematopoietic stem cells (HSCs) using flow cytometry and confirmed lower level of FLT3-expression on HSCs and progenitors compared to AML cells. As anticipated, we found that FLT3 CAR-T cells recognize normal HSCs in vitro and in vivo, and compromise normal hematopoiesis, suggesting that adoptive therapy with FLT3 CAR-T cells will require successive CAR-T cell depletion and allogeneic HSC transplantation (HSCT) to reconstitute the hematopoietic system. Moreover, an FLT3 inhibitor treatment does not increase FLT3-expression on HSCs. Accordingly, we demonstrate that the depletion of FLT3 CAR-T cells is possible with inducible Caspase 9 (iCasp9) safety switch. Collectively, our data establish FLT3 as a novel CAR target in AML with particular relevance in high-risk FLT3-ITD+ AML. Our data demonstrate that FLT3 CAR-T cells act synergistically with FLT3 inhibitors in FLT3-ITD+ AML. i.e. FLT3 inhibitors-induced upregulation of FLT3 in FLT3-ITD+ AML cells enhances their recognition and elimination by FLT3 CAR-T cells. Due to recognition of normal HSCs, the clinical use of FLT3 CART cells is likely restricted to a defined therapeutic window and must be followed by CART cell depletion and allogeneic HSCT for hematopoietic reconstitution. The data provide rational to use FLT3 CAR-T cells in combination with FLT3 inhibitors to augment the anti-leukemia efficacy of FLT3 CAR-T cells in high-risk FLT3-ITD+ AML patients, and to mitigate the risk of relapse with FLT3-negative AML variants, which could otherwise develop under therapeutic pressure. The data provide proof of concept for synergistic use of CAR-T cell immunotherapy and small molecule targeted therapy and encourage the clinical evaluation of this combination treatment in high-risk patients with FLT3-ITD+ AML. / Adoptive Immuntherapie, die Chimäre- Antigenrezeptor (CAR) –modifizierte, gegen CD19 gerichtet T-Zellen verwendet, hat eine bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeit gegen B-Zell-Leukämien und -Lymphome und großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung anderer hämatologischer Erkrankungen gezeigt. Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist hierbei eine Entität, für die es bisher an wirksamen und kurativen Therapien fehlt und für die die Entwicklung einer potentiell kurativen CAR-T-Zellimmuntherapie von großer Bedeutung ist. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) ist ein homodimeres Transmembranprotein, das von AML-Blasten uniform exprimiert wird. FLT3 spielt eine wichtige Rolle beim Überleben von AML-Blasten und ist ein Schlüsselfaktor in der Leukämie-Genese bei AML-Fällen mit interner Tandem-Duplikation (FLT3-ITD) und Tyrosinkinase-Domänen (TKD)-Mutationen. Diese Eigenschaften legen die Vermutung nahe, dass FLT3 ein ausgezeichnetes Target für die CAR-T-Zell-Immuntherapie darstellen könnte. Daher setzten wir dort an und modifizierten humane CD4+ und CD8+ T-Zellen, um FLT3-spezifische CARs zu exprimieren, und konnten nachweisen, dass diese eine starke Reaktivität gegen AML-Zelllinien und primäre AML-Blasten besitzen, die entweder den FLT3-Wildtyp oder FLT3-ITD exprimieren. Weiterhin konnten wir zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen in AML-Xenograft-Modellen eine starke anti-Leukämie-Aktivität besitzen und vollständige Remissionen hervorrufen können. Zudem gelang der Nachweis, dass die FLT3-Expression auf FLT3-ITD+ AML-Zellen durch FLT3-Inhibitoren verstärkt werden kann, was zu einer erhöhten Erkennung durch die CARs und einer verbesserten Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen führt. Wir konnten dieses Prinzip mit drei verschiedenen FLT3-Inhibitoren belegen, die sich in unterschiedlichen Stadien der klinischen Entwicklung befinden, d. h. aus einer Klinischen Phase II / III-Studie (Crenolanib, Quizartinib) und einem klinisch zugelassenen Inhibitor (Midostaurin). Darüber hinaus beobachteten wir die stärkste anti-Leukämie-Aktivität von FLT3 CAR-T-Zellen in einer Kombination mit Crenolanib in vivo. Es ist bekannt, dass FLT3 von normalen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert wird. Wir untersuchten die FLT3-Expression in normalen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) mittels Durchflusszytometrie und bestätigten im Vergleich zu AML-Zellen eine niedrigere FLT3-Expression auf HSCs und Vorläuferzellen. Wie erwartet, zeigte sich, dass FLT3 CAR-T-Zellen normale HSCs in vitro und in vivo erkennen und die normale Hämatopoese beeinträchtigen, was darauf hindeutet, dass eine adoptive Therapie mit FLT3 CAR-T-Zellen eine sukzessive CAR-T-Zell-Depletion und allogene HSC-Transplantation erfordert, um das hämatopoetische System wiederaufzubauen. Darüber hinaus erhöht die Behandlung mit einem FLT3-Inhibitor nicht die FLT3-Expression auf den HSCs. Dementsprechend konnten wir aufzeigen, dass die Depletion von FLT3 CAR-T Zellen mit einer induzierbaren Caspase 9 (iCasp9) als „Sicherheitsschalter“ möglich ist. Zusammenfassend etablieren unsere Daten FLT3 als ein neuartiges CAR-Target in der Behandlung von AML mit besonderer Relevanz für die Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML. Unsere Daten zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen synergistisch mit FLT3-Inhibitoren in FLT3-ITD+ AML wirken, d.h. eine FLT3-Inhibitoren-induzierte Hochregulation von FLT3 in FLT3-ITD+ AML-Zellen bewirkt und dies die Erkennung und Eliminierung durch FLT3-CAR-T-Zellen verstärkt. Durch ihre Eigenschaft der Erkennung von normalen HSCs ist die klinische Verwendung von FLT3 CAR-T-Zellen wahrscheinlich auf ein definiertes therapeutisches Fenster beschränkt und muss durch eine anschließende CAR-T-Zell-Depletion und eine allogene HSCT zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems ergänzt werden. In Anbetracht der Daten scheint es sinnvoll, FLT3-CAR-T-Zellen in Kombination mit FLT3-Inhibitoren zu verwenden, um die anti-leukämische Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen bei Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML-Patienten zu erhöhen und das Risiko eines Rückfalls mit FLT3-negativen AML-Varianten zu verringern, die sich sonst therapiebedingt entwickeln könnten. Die Daten stellen ein Proof-of-Concept für den synergistischen Einsatz von CAR-T-Zell-Immuntherapie und niedermolekularen Inhibitoren dar, der eine klinische Evaluation dieser Kombinationsbehandlung bei Hochrisikopatienten mit FLT3-ITD+ AML erstrebenswert macht.