Le but de cette thèse est de développer une stratégie pro-apoptotique à partir des paramètres pouvant moduler l’apoptose photoinduite par le Foscan® dans des modèles précliniques d’adénocarcinome humain. La PDT avec le Foscan® a été appliquée in vitro sur lignées cellulaires où une apoptose modérée a été obtenue via l’implication indirecte de la voie mitochondriale. La modulation de l’apoptose photoinduite par l’oxygénation a été démontrée sur sphéroïde, modèle de micro-tumeur non vascularisée. Une irradiance faible, garantissant le maintien de l’oxygénation du sphéroïde, favorise l’activation de la caspase-3 photoinduite par le Foscan®. Le deuxième paramètre favorisant l’apoptose photoinduite est l’accroissement du temps d’incubation du photosensibilisateur avec les cellules MCF-7, ce qui modifie sa localisation subcellulaire. Après 3h d’incubation, le Foscan® est essentiellement localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) et l’appareil de Golgi. Après irradiation, le stress oxydant du RE évalué par l’induction de la protéine chaperone GRP78 suivie de la réponse apoptotique mitochondriale et de l’activation des caspases a été observée. Après 24h d’incubation, la localisation dans le RE est renforcée ainsi que l’expression photoinduite de GRP78 corrélée avec une augmentation de l’activation caspase-7 indépendamment de la réponse mitochondriale. Après PDT in vivo, l’estimation par immunohistochimie sur coupe tissulaire de l’activation des caspases -7 et -3 montre une activation prédominante de la caspase-3 ce qui suggère une apoptose majoritairement dépendante de cette dernière dans les tumeurs d’adénocarcinome colique HT29 traitées par Foscan®-PDT. / In order to develop a proapoptotic strategy in Foscan®-mediated photodynamic therapy (PDT) an evaluation of the parameters that govern the modulation of photoinduced apoptosis was performed on preclinical model from human adenocarcinoma. Moderate apoptosis was measured in Foscan® photosensitised tumour cells in vitro. The mitochondrial pathway was assumed to be indirectly induced by Foscan®-PDT. Spheroids were used to investigate the influence of oxygen consumption, through the modulation of fluence rate, on the induction of apoptosis. By using a low fluence rate, an oxygen conservative regimen, we demonstrated an increase in the activation of caspase-3 induced by Foscan®-PDT. The modulation of photoinduced apoptosis by extending the incubation time of Foscan® with MCF-7 cells was further investigated. After 3h incubation, the photosensitizer was mainly localised in the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus. Following irradiation, ER oxidative stress through the induction of the chaperon protein GRP78 was observed. Subsequent apoptotic mitochondria response and caspase activation were induced. After 24h incubation with Foscan®, the ER localisation of the photosensitizer was intensified. As results, an increase in GRP78 expression correlated with an increase in caspase-7 activation independently of the mitochondria response was obtained. After in vivo PDT, immunohistochemistry was applied on tissue sections to evaluate the activation of caspases -3 and -7. Caspase-3 activation was found predominant suggesting a caspase-3 mediated apoptotic pathway in HT29 tumours subjected to Foscan®-PDT.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica que vem atuar no tratamento de diversos tipos de câncer, com interesse crescente nas últimas décadas. Atuando de forma pouco invasiva e complementar as terapias tradicionais, a TFD consiste basicamente na administração sistêmica ou tópica de um fármaco fotossensibilizador (FS) seguido pela exposição da lesão à luz visível resultando na regressão tumoral caracterizada por processos de morte celular, sendo que, o fármaco fotossensibilizador e a radiação luminosa separadamente não induzem nenhum tipo de dano aos tecidos. A radiação monocromática utilizada na maioria dos casos é do tipo LASER sendo direcionada sobre a lesão por um conjunto de fibras ópticas. A maioria dos estudos até o presente momento sugerem um mecanismo comum de ação para a TFD. Após a excitação do fotossensibilizador para os estados excitados singlete e triplete, e por transferência de energia para o oxigênio molecular (O2) leva a morte tumoral ocasionada por espécies reativas de oxigênio definidas como EROS (1O2, O2_ ,OH, H2O2) além de outras formas radicalares (CH3, NO2, R-CO2, etc.) que atacam centros específicos dentro dos sistemas celulares, desencadeando a morte de tais tecidos por processos de necrose e/ou apoptose celular. Neste trabalho de pesquisa avaliamos a interação do fármaco fotossensibilizador Foscan® com Nanoemulsões biodegradáveis como sistemas de liberação em TFD-tópica. Na primeira etapa do trabalho foram realizados estudos físico-químicos para avaliação da estabilidade termodinâmica e determinação de alguns parâmetros morfológicos. Consecutivamente, determinamos a caracterização fotofísica do fotossensibilizador em ambiente coloidal empregando-se técnicas de espectroscopia no estado estacionário e resolvida no tempo. Foi possível determinar importantes parâmetros que elucidaram o potencial fotodinâmico do sistema fármaco/veículo, confirmando sua viabilidade para aplicação em Terapia Fotodinâmica. A última parte do trabalho de dissertação consiste na determinação do perfil de interação cutânea do sistema a partir de estudos in vitro em modelo animal. Empregando-se protocolos de permeação e retenção cutânea, foram determinados os fluxos difusionais para, a taxa de retenção tecidual e o tempo de latência. Portanto, com estes estudos concluímos que o sistema Foscan®/NE apresenta caracterísiticas favoráveis que lhe conferem grande potencial para aplicação em TFD, dando margem para estudos in vivo e em fase clínica. / Photodynamic Therapy (PDT) is the therapeutics that comes to act in the treatment of several cancer types, with growing interest in the last decades. Acting in way a complemental the traditional therapies, PDT consists basically of the administration systemic or topical of a photosensitizer drug (FS) following for the exhibition of the lesion to the visible light resulting in the regression tumoral characterized by processes of cellular death, and, the photosensitizer drug and the luminous radiation separately don\'t induce any damage type to the lesion. The monochrome radiation used in most of the cases is of the type LASER being addressed on the lesion by a group of fiber optic. Most of the studies to the present moment they suggest a mechanism common of action for PDT. After the excitement of the PS for the states excited singlet and triplet, and for transfer of energy for the molecular oxygen (O2) it takes the death tumoral caused by species reactivate of oxygen defined like ROS (1O2, O2_ ,OH, H2O2) besides other forms radicalares (CH3, NO2, R-CO2, etc.) that attack specific centers inside of the cellular systems, unchaining the death of such woven by necrosis processes and/or cellular apoptosis. In this research work we evaluated the interaction of the photosensitizer drug Foscan® with biodegradable nanoemulsion (NE) as drug delivery system (DDS) in PDT-topical. In the first step of the work physiochemical studies were accomplished for evaluation of the thermodynamic stability and determination of some morphologic parameters. Consecutively, we determined the photophysical characterization of the drug in colloidal medium being used spectroscope techniques in the stationary state and in the time function. It was possible to determine important parameters that elucidated the photodynamic potential of the system (DDS), confirming its viability for application in PDT. The last step of the dissertation work consists of the determination of the profile of cutaneous interaction of the system starting from studies in vitro in animal model. Being used permeation protocols and cutaneous retention, they were certain the diffusion flux, the index of retention, skin up-take and the time-lag. Therefore, with these studies we ended that the system Foscan®/NE showed characteristics favorable and great potential for application in PDT-topical giving sequence to futures studies in vivo and in clinical phase.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica que vem atuar no tratamento de diversos tipos de câncer, com interesse crescente nas últimas décadas. Atuando de forma pouco invasiva e complementar as terapias tradicionais, a TFD consiste basicamente na administração sistêmica ou tópica de um fármaco fotossensibilizador (FS) seguido pela exposição da lesão à luz visível resultando na regressão tumoral caracterizada por processos de morte celular, sendo que, o fármaco fotossensibilizador e a radiação luminosa separadamente não induzem nenhum tipo de dano aos tecidos. A radiação monocromática utilizada na maioria dos casos é do tipo LASER sendo direcionada sobre a lesão por um conjunto de fibras ópticas. A maioria dos estudos até o presente momento sugerem um mecanismo comum de ação para a TFD. Após a excitação do fotossensibilizador para os estados excitados singlete e triplete, e por transferência de energia para o oxigênio molecular (O2) leva a morte tumoral ocasionada por espécies reativas de oxigênio definidas como EROS (1O2, O2_ ,OH, H2O2) além de outras formas radicalares (CH3, NO2, R-CO2, etc.) que atacam centros específicos dentro dos sistemas celulares, desencadeando a morte de tais tecidos por processos de necrose e/ou apoptose celular. Neste trabalho de pesquisa avaliamos a interação do fármaco fotossensibilizador Foscan® com Nanoemulsões biodegradáveis como sistemas de liberação em TFD-tópica. Na primeira etapa do trabalho foram realizados estudos físico-químicos para avaliação da estabilidade termodinâmica e determinação de alguns parâmetros morfológicos. Consecutivamente, determinamos a caracterização fotofísica do fotossensibilizador em ambiente coloidal empregando-se técnicas de espectroscopia no estado estacionário e resolvida no tempo. Foi possível determinar importantes parâmetros que elucidaram o potencial fotodinâmico do sistema fármaco/veículo, confirmando sua viabilidade para aplicação em Terapia Fotodinâmica. A última parte do trabalho de dissertação consiste na determinação do perfil de interação cutânea do sistema a partir de estudos in vitro em modelo animal. Empregando-se protocolos de permeação e retenção cutânea, foram determinados os fluxos difusionais para, a taxa de retenção tecidual e o tempo de latência. Portanto, com estes estudos concluímos que o sistema Foscan®/NE apresenta caracterísiticas favoráveis que lhe conferem grande potencial para aplicação em TFD, dando margem para estudos in vivo e em fase clínica. / Photodynamic Therapy (PDT) is the therapeutics that comes to act in the treatment of several cancer types, with growing interest in the last decades. Acting in way a complemental the traditional therapies, PDT consists basically of the administration systemic or topical of a photosensitizer drug (FS) following for the exhibition of the lesion to the visible light resulting in the regression tumoral characterized by processes of cellular death, and, the photosensitizer drug and the luminous radiation separately don\'t induce any damage type to the lesion. The monochrome radiation used in most of the cases is of the type LASER being addressed on the lesion by a group of fiber optic. Most of the studies to the present moment they suggest a mechanism common of action for PDT. After the excitement of the PS for the states excited singlet and triplet, and for transfer of energy for the molecular oxygen (O2) it takes the death tumoral caused by species reactivate of oxygen defined like ROS (1O2, O2_ ,OH, H2O2) besides other forms radicalares (CH3, NO2, R-CO2, etc.) that attack specific centers inside of the cellular systems, unchaining the death of such woven by necrosis processes and/or cellular apoptosis. In this research work we evaluated the interaction of the photosensitizer drug Foscan® with biodegradable nanoemulsion (NE) as drug delivery system (DDS) in PDT-topical. In the first step of the work physiochemical studies were accomplished for evaluation of the thermodynamic stability and determination of some morphologic parameters. Consecutively, we determined the photophysical characterization of the drug in colloidal medium being used spectroscope techniques in the stationary state and in the time function. It was possible to determine important parameters that elucidated the photodynamic potential of the system (DDS), confirming its viability for application in PDT. The last step of the dissertation work consists of the determination of the profile of cutaneous interaction of the system starting from studies in vitro in animal model. Being used permeation protocols and cutaneous retention, they were certain the diffusion flux, the index of retention, skin up-take and the time-lag. Therefore, with these studies we ended that the system Foscan®/NE showed characteristics favorable and great potential for application in PDT-topical giving sequence to futures studies in vivo and in clinical phase.

Le but de cette thèse est de développer une stratégie pro-apoptotique à partir des paramètres pouvant moduler l'apoptose photoinduite par le Foscan® dans des modèles précliniques d'adénocarcinome humain. La PDT avec le Foscan® a été appliquée in vitro sur lignées cellulaires où une apoptose modérée a été obtenue via l'implication indirecte de la voie mitochondriale. La modulation de l'apoptose photoinduite par l'oxygénation a été démontrée sur sphéroïde, modèle de micro-tumeur non vascularisée. Une irradiance faible, garantissant le maintien de l'oxygénation du sphéroïde, favorise l'activation de la caspase-3 photoinduite par le Foscan®. Le deuxième paramètre favorisant l'apoptose photoinduite est l'accroissement du temps d'incubation du photosensibilisateur avec les cellules MCF-7, ce qui modifie sa localisation subcellulaire. Après 3h d'incubation, le Foscan® est essentiellement localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) et l'appareil de Golgi. Après irradiation, le stress oxydant du RE évalué par l'induction de la protéine chaperone GRP78 suivie de la réponse apoptotique mitochondriale et de l'activation des caspases a été observée. Après 24h d'incubation avec le Foscan®, la localisation dans le RE est renforcée ainsi que l'expression photoinduite de GRP78 corrélée avec une augmentation de l'activation de la caspase-7 indépendamment de la réponse mitochondriale. Après PDT in vivo, l'estimation par immunohistochimie sur coupe tissulaire de l'activation de la caspase-7 et de la caspase-3 montre une activation prédominante de la caspase-3 ce qui suggère une apoptose majoritairement dépendante de la caspase-3 dans les tumeurs d'adénocarcinome colique HT29 traitées par Foscan®-PDT.