A infecção persistente por HPV-16 está fortemente associada ao risco de desenvolvimento de neoplasias do colo do útero, vagina, vulva, pênis, canal anal e orofaringe. O estudo detalhado da variabilidade nucleotídica intra-típica de HPV-16 resultou em importantes achados no que concerne à filogenia e evolução viral, e à história natural das infecções. Variantes Asiático-Americanas (AA) e E-350G de HPV-16 foram associadas com maior risco de persistência da infecção viral e desenvolvimento de câncer de colo de útero quando comparadas à variante Européia protótipo (E-P ou E-350T), embora esta ainda apresente alto risco quando comparada aos outros tipos virais. Mais recentemente, diferenças funcionais entre as proteínas E6/E7 das distintas variantes moleculares de HPV- 16 estão sendo descritas, a fim de explicar as diferenças nas associações epidemiológicas observadas. Dados do nosso grupo apontaram para a transcrição aumentada do gene MEK2 especificamente em queratinócitos humanos primários (PHKs) transduzidos com E6/E7 da variante E-350G. Pelo exposto, objetivou-se: (1) Analisar os níveis de ativação de proteínas efetoras das vias de transdução de sinal mediadas por MAPK e PI3K/AKT em queratinócitos imortalizados por E6/E7 de três variantes moleculares de HPV-16 (AA, E-P, E-350G); (2) Analisar os efeitos das proteínas E6/E7 dessas variantes sob as vias de MAPK quanto à indução de fatores de transcrição; (3) Analisar o potencial transformante de PHKs imortalizados pelas diferentes variantes, e em cooperação com a proteína celular c-MYC; (4) Analisar o potencial de migração e invasão em PHKs imortalizados pelas diferentes variantes de HPV-16, e em cooperação com a proteína celular c-MYC. Neste estudo observou-se que a variante AA de HPV-16 induziu a maior ativação das vias de sinalização estudadas (MAPK, e PI3K/AKT). Ademais, PHKs imortalizados por esta variante apresentaram maior capacidade de migração, de invasão através de uma matriz de colágeno, além de maior potencial transformante. Adicionalmente, as células imortalizadas pela variante AA apresentaram maior expressão da proteína mesenquimal vimentina e diminuição dos níveis da proteína epitelial E-caderina, sugerindo ativação parcial de Transição Epitélio Mesênquima (EMT) nestes queratinócitos. Ademais, quando o oncogene c-MYC foi co-transduzido nas diferentes linhagens infectadas por E6/E7 de HPV-16, foi observado que em PHKs imortalizados pela variante AA também houve maior ativação da via de MAPK-ERK, maior migração, e um potencial transformante semelhante, em relação às células co-transduzidas pela variante E-350G e c-MYC. Em conjunto, estes dados sugerem que a variante AA de HPV-16 possui vantagem seletiva sob as outras variantes em promover transformação celular, migração e invasão, e isto poderia explicar, ao menos em parte, a maior prevalência desta variante no câncer cervical. Os resultados gerados neste estudo são de extrema relevância para avaliar o impacto da variabilidade intra-típica de HPV-16 sobre o potencial oncogênico observado em estudos epidemiológicos / Persistent infection with HPV-16 is strongly associated with risk of developing neoplasia in the uterine cervix, vagina, vulva, penis, anal canal and oropharynx. The detailed study of HPV-16 intra-typical nucleotide variability resulted in important findings regarding phylogeny and viral evolution, and the natural history of infections. Asian-American (AA) and E-350G variants of HPV-16 were associated with increased risk of persistent viral infection and development of cervical cancer compared to the European prototype (E-P or E-350T), although this variant still presents higher risk when compared to other viral types. More recently, functional differences between the E6/E7 proteins of distinct molecular variants of HPV-16 are being described, in order to explain the differences in the epidemiological associations observed. Data from our group pointed to increased transcription of the MEK2 gene specifically in primary human keratinocytes (PHKs) transducing E6/E7 of the E-350G variant. Consequently, the aims of this study were: 1) To examine the activation levels of effector proteins of the signal transduction pathways mediated by MAPK and PI3K/AKT in PHKs immortalized by E6/E7 of three different molecular variants of HPV-16 (AA, E-P, E-350G); (2) To analyze the effects of E6/E7 of different molecular variants of HPV-16 upon MAPK pathways concerning the induction of transcription factors; (3) To analyze the transforming potential of PHKs immortalized by different molecular variants of HPV-16, and in cooperation with the cellular protein c- MYC; (4) To analyze the potential of migration and invasion in PHKs immortalized by different molecular variants of HPV-16, and in cooperation with the cellular protein c- MYC. In this study we observed that the AA variant of HPV-16 induced higher activation of both signaling pathways studied (MAPK, and PI3K/AKT). Furthermore, this variant presented increased migration capacity, higher invasion through a collagen matrix, and greater transforming potential. Moreover, cells immortalized by the AA variant showed higher expression of the mesenchymal protein vimentin and a decrease of the epithelial protein E-cadherin, suggesting partial activation of Epithelial Mesenchymal Transition (EMT). In addition, when the c-MYC oncogene was co-transduced in the different cells lines infected with HPV-16 E6/E7, we observed that in PHKs immortalized by the AA variant there was also an enhanced activation of the MAPK-ERK pathway, a higher ability to migrate, and similar transformation potential in comparison with cells co-transduced with the E-350G variant and c-MYC. Taken together, this data suggest that the AA molecular variant of the HPV-16 has a selective advantage over the other variants to promote cell transformation, migration and invasion, and this could partly explain the higher prevalence of this variant in cervical cancer. The results generated in this study are very important to assess the impact of intra-typical variability of HPV-16 on the oncogenic potential observed in epidemiological studies

A infecção persistente por HPV-16 está fortemente associada ao risco de desenvolvimento de neoplasias do colo do útero, vagina, vulva, pênis, canal anal e orofaringe. O estudo detalhado da variabilidade nucleotídica intra-típica de HPV-16 resultou em importantes achados no que concerne à filogenia e evolução viral, e à história natural das infecções. Variantes Asiático-Americanas (AA) e E-350G de HPV-16 foram associadas com maior risco de persistência da infecção viral e desenvolvimento de câncer de colo de útero quando comparadas à variante Européia protótipo (E-P ou E-350T), embora esta ainda apresente alto risco quando comparada aos outros tipos virais. Mais recentemente, diferenças funcionais entre as proteínas E6/E7 das distintas variantes moleculares de HPV- 16 estão sendo descritas, a fim de explicar as diferenças nas associações epidemiológicas observadas. Dados do nosso grupo apontaram para a transcrição aumentada do gene MEK2 especificamente em queratinócitos humanos primários (PHKs) transduzidos com E6/E7 da variante E-350G. Pelo exposto, objetivou-se: (1) Analisar os níveis de ativação de proteínas efetoras das vias de transdução de sinal mediadas por MAPK e PI3K/AKT em queratinócitos imortalizados por E6/E7 de três variantes moleculares de HPV-16 (AA, E-P, E-350G); (2) Analisar os efeitos das proteínas E6/E7 dessas variantes sob as vias de MAPK quanto à indução de fatores de transcrição; (3) Analisar o potencial transformante de PHKs imortalizados pelas diferentes variantes, e em cooperação com a proteína celular c-MYC; (4) Analisar o potencial de migração e invasão em PHKs imortalizados pelas diferentes variantes de HPV-16, e em cooperação com a proteína celular c-MYC. Neste estudo observou-se que a variante AA de HPV-16 induziu a maior ativação das vias de sinalização estudadas (MAPK, e PI3K/AKT). Ademais, PHKs imortalizados por esta variante apresentaram maior capacidade de migração, de invasão através de uma matriz de colágeno, além de maior potencial transformante. Adicionalmente, as células imortalizadas pela variante AA apresentaram maior expressão da proteína mesenquimal vimentina e diminuição dos níveis da proteína epitelial E-caderina, sugerindo ativação parcial de Transição Epitélio Mesênquima (EMT) nestes queratinócitos. Ademais, quando o oncogene c-MYC foi co-transduzido nas diferentes linhagens infectadas por E6/E7 de HPV-16, foi observado que em PHKs imortalizados pela variante AA também houve maior ativação da via de MAPK-ERK, maior migração, e um potencial transformante semelhante, em relação às células co-transduzidas pela variante E-350G e c-MYC. Em conjunto, estes dados sugerem que a variante AA de HPV-16 possui vantagem seletiva sob as outras variantes em promover transformação celular, migração e invasão, e isto poderia explicar, ao menos em parte, a maior prevalência desta variante no câncer cervical. Os resultados gerados neste estudo são de extrema relevância para avaliar o impacto da variabilidade intra-típica de HPV-16 sobre o potencial oncogênico observado em estudos epidemiológicos / Persistent infection with HPV-16 is strongly associated with risk of developing neoplasia in the uterine cervix, vagina, vulva, penis, anal canal and oropharynx. The detailed study of HPV-16 intra-typical nucleotide variability resulted in important findings regarding phylogeny and viral evolution, and the natural history of infections. Asian-American (AA) and E-350G variants of HPV-16 were associated with increased risk of persistent viral infection and development of cervical cancer compared to the European prototype (E-P or E-350T), although this variant still presents higher risk when compared to other viral types. More recently, functional differences between the E6/E7 proteins of distinct molecular variants of HPV-16 are being described, in order to explain the differences in the epidemiological associations observed. Data from our group pointed to increased transcription of the MEK2 gene specifically in primary human keratinocytes (PHKs) transducing E6/E7 of the E-350G variant. Consequently, the aims of this study were: 1) To examine the activation levels of effector proteins of the signal transduction pathways mediated by MAPK and PI3K/AKT in PHKs immortalized by E6/E7 of three different molecular variants of HPV-16 (AA, E-P, E-350G); (2) To analyze the effects of E6/E7 of different molecular variants of HPV-16 upon MAPK pathways concerning the induction of transcription factors; (3) To analyze the transforming potential of PHKs immortalized by different molecular variants of HPV-16, and in cooperation with the cellular protein c- MYC; (4) To analyze the potential of migration and invasion in PHKs immortalized by different molecular variants of HPV-16, and in cooperation with the cellular protein c- MYC. In this study we observed that the AA variant of HPV-16 induced higher activation of both signaling pathways studied (MAPK, and PI3K/AKT). Furthermore, this variant presented increased migration capacity, higher invasion through a collagen matrix, and greater transforming potential. Moreover, cells immortalized by the AA variant showed higher expression of the mesenchymal protein vimentin and a decrease of the epithelial protein E-cadherin, suggesting partial activation of Epithelial Mesenchymal Transition (EMT). In addition, when the c-MYC oncogene was co-transduced in the different cells lines infected with HPV-16 E6/E7, we observed that in PHKs immortalized by the AA variant there was also an enhanced activation of the MAPK-ERK pathway, a higher ability to migrate, and similar transformation potential in comparison with cells co-transduced with the E-350G variant and c-MYC. Taken together, this data suggest that the AA molecular variant of the HPV-16 has a selective advantage over the other variants to promote cell transformation, migration and invasion, and this could partly explain the higher prevalence of this variant in cervical cancer. The results generated in this study are very important to assess the impact of intra-typical variability of HPV-16 on the oncogenic potential observed in epidemiological studies