Esta tese descreve estudos realizados na tentativa de purificar e caracterizar enzimas envolvidas na BL de fungos, além de trabalhos conduzidos a fim de investigar o mecanismo da bioluminescência de fungos. Inicialmente, tentou-se isolar as duas enzimas supostamente responsáveis pala reação bioluminescente em fungos. Parâmetros de atividade ótima (pH e temperatura) e comportamento cinético foram investigados. Todavia, com a descoberta de que a luciferina fúngica é o derivado hidroxilado da hispidina (3-hidróxihispidina), novas estratégias foram abordadas. Os esforços se concentraram na purificação da luciferase, visto que a hidroxilase não faz parte do sistema bioluminescente de fungos. Avaliação da interação da luciferase fúngica com a luciferina ou derivados dela sugeriram comportamento relativamente promíscuo da enzima. Os resultados indicaram que a reação luciferina-luciferase é favorecida em meio básico (pH ~8), a ~20 °C. Ensaios com 18O2 revelaram que a inserção de oxigênio na molécula de luciferina produz um intermediário cuja descarboxilação gera a oxiluciferina. Paralelamente, a síntese da hispidina in vitro a partir de ácido cafeico na presença de malonil-CoA e de extrato de micélios bioluminescentes resultou na emissão de luz, confirmando que a luciferina é reciclada no processo. / This work describes studies performed to purify and characterize enzymes responsible for the fungal bioluminescence. Also, it shows important data that contributes to understand the mechanism for bioluminescence reaction in fungi. First, we tried to isolate two enzymes suspected of being involved on fungal bioluminescence. Optimum activity parameters (pH and temperature) and kinetic behavior were investigated. However, the discovery that fungal luciferin is the hispidin derivative 3-hydroxyhispidin demanded adaptations in the project. First of all, concentrates efforts to luciferase purification was priority, since hydroxylase is not part of the bioluminescent system of fungi. Studies on the luciferase interaction with different substrates showed some promiscuity for the enzyme. The results indicated higher intensity of light from luciferin-luciferase reaction in alkaline solutions (pH ~ 8) at ~ 20 °C. The reaction in medium with 18O2 revealed that insertion of oxygen into the luciferin structure produces an intermediate whose decarboxylation generates oxyluciferin. In parallel, the in vitro synthesis of hispidin using caffeic acid and malonyl-CoA with the mycelium extract resulted in the emission of light, confirming that luciferin is recycled in the process.

Esta tese descreve estudos realizados na tentativa de purificar e caracterizar enzimas envolvidas na BL de fungos, além de trabalhos conduzidos a fim de investigar o mecanismo da bioluminescência de fungos. Inicialmente, tentou-se isolar as duas enzimas supostamente responsáveis pala reação bioluminescente em fungos. Parâmetros de atividade ótima (pH e temperatura) e comportamento cinético foram investigados. Todavia, com a descoberta de que a luciferina fúngica é o derivado hidroxilado da hispidina (3-hidróxihispidina), novas estratégias foram abordadas. Os esforços se concentraram na purificação da luciferase, visto que a hidroxilase não faz parte do sistema bioluminescente de fungos. Avaliação da interação da luciferase fúngica com a luciferina ou derivados dela sugeriram comportamento relativamente promíscuo da enzima. Os resultados indicaram que a reação luciferina-luciferase é favorecida em meio básico (pH ~8), a ~20 °C. Ensaios com 18O2 revelaram que a inserção de oxigênio na molécula de luciferina produz um intermediário cuja descarboxilação gera a oxiluciferina. Paralelamente, a síntese da hispidina in vitro a partir de ácido cafeico na presença de malonil-CoA e de extrato de micélios bioluminescentes resultou na emissão de luz, confirmando que a luciferina é reciclada no processo. / This work describes studies performed to purify and characterize enzymes responsible for the fungal bioluminescence. Also, it shows important data that contributes to understand the mechanism for bioluminescence reaction in fungi. First, we tried to isolate two enzymes suspected of being involved on fungal bioluminescence. Optimum activity parameters (pH and temperature) and kinetic behavior were investigated. However, the discovery that fungal luciferin is the hispidin derivative 3-hydroxyhispidin demanded adaptations in the project. First of all, concentrates efforts to luciferase purification was priority, since hydroxylase is not part of the bioluminescent system of fungi. Studies on the luciferase interaction with different substrates showed some promiscuity for the enzyme. The results indicated higher intensity of light from luciferin-luciferase reaction in alkaline solutions (pH ~ 8) at ~ 20 °C. The reaction in medium with 18O2 revealed that insertion of oxygen into the luciferin structure produces an intermediate whose decarboxylation generates oxyluciferin. In parallel, the in vitro synthesis of hispidin using caffeic acid and malonyl-CoA with the mycelium extract resulted in the emission of light, confirming that luciferin is recycled in the process.