Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2015 / ENGLISH ABSTRACT: Maize (Zea mays L.) is an important crop worldwide and forms the staple diet of many African countries including South Africa. Fusarium ear rot (FER) of maize is caused by a fungus, Fusarium verticillioides, which also produces the fumonisin mycotoxin group. The consumption of fumonisin contaminated maize grain has been associated with serious human and animal health complications. Several South African maize inbred lines exhibiting resistance to FER and fumonisin contamination have been identified. These locally adapted inbred lines could be used to generate mapping populations to identify QTLs associated with resistance to FER and fumonisin contamination. The corresponding markers could be utilised in breeding programmes through marker-assisted selection to ensure the development of commercial cultivars with resistance to FER and fumonisin contamination. In this study, resistant and susceptible maize inbred lines were utilised to commence the development of recombinant inbred line (RIL) populations for the mapping and validation of QTLs associated with FER and fumonisin resistance. One F2 population was phenotypically and genotypically analysed to produce a linkage map for the preliminary identification of QTLs associated with resistance to F. verticillioides infection and fumonisin deposition. A potential QTL for resistance to FER was detected and should be validated across several locations and years in the subsequent RIL population. Additionally, potential resistance barriers of maize to infection by F. verticillioides were investigated by histological studies. The importance of a closed stylar canal in determining resistance to FER was established for nine South African maize inbred lines by means of scanning electron microscopy (SEM). No significant association was observed between a closed stylar canal and the resistance/susceptible status of maize inbred lines before pollination, while the canals appeared closed in all inbred lines following pollination. The results suggest that the stylar canal architecture is not an essential factor determining resistance to F. verticillioides ingress in the maize inbred lines selected for this study. Furthermore, the possibility of resistance to FER and fumonisin contamination being initiated during the seedlings phase of a resistant and susceptible maize inbred line was investigated by means of confocal laser scanning microscopy (CLSM). Fusarium verticillioides growth originating from soil-borne or seed-borne contamination was monitored in various above and below soil plant tissues but no significant difference in the colonisation could be determined between resistant and susceptible maize seedlings. No fumonisin was produced regardless of the inoculation method or resistance status of the plant. These results suggests that the resistant and susceptible maize seedlings used in this study may not be resistant to systemic fungal ingress but may resist the deposition of fumonisins. The resistance associated with the resistant inbred line is not mediated during the seedling phase but potentially through structural and biochemical defence mechanisms during later plant developmental stages. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Mielies (Zea mays L.) is ‘n belangrike graangewas wat wêreldwyd geproduseer word en dien as stapelvoedsel in talle Afrika-lande, insluitend Suid-Afrika. Fusarium kopvrot (FKV) in mielies word veroorsaak deur die swam, Fusarium verticillioides, wat ook die fumonisien mikotoksien groepe produseer. Die inname van fumonisien-geïnfekteerde mielies gaan gepaard met ernstige gesondheidsprobleme in mense en diere. Verskeie Suid-Afrikaanse ingeteelde mielielyne, wat weerstandbiedend is teen FKV en fumonisien kontaminasie, is voorheen identifiseer. Hierdie plaaslik-aangepaste teellyne kan gebruik word om kartering populasies te genereer om kwantitatiewe eienskap loci (KEL) te identifiseer wat verband hou met weerstandbiedenheid teen FKV en fumonisien kontaminasie. Die ooreenstemmende merkers kan gebruik word in teelprogramme deur gebruik te maak van merker-geassisteerde seleksie om kommersieële kultivars, wat weerstandbiedend is teenoor FKV en fumonisien kontaminasie, te ontwikkel. In hierdie studie is weerstandbiedende en vatbare mielie inteellyne gebruik om rekombinante inteellyn (RIL) populasies te begin ontwikkel vir die kartering en validasie van KEL’e geassosieer met FKV en fumonisien weerstandbiedenheid. Een F2 populasie was fenotipies en genotipies geanaliseer om ‘n koppeling-kaart te verwek vir die voorlopige identifikasie van KEL’e geassosieer met weerstandigheid tot F. verticillioides infeksie en fumonisein afsetting. ‘n Potensiële KEL vir weerstandbiedenheid is geïdentifiseer, wat verdere bevestiging in die daaropvolgende RIL populasie in verskeie geografiese areas en oor addisionele seisoene, benodig. Potensiële fisiese versperrings teen F. verticillioides tydens mieliesaad infeksie is ook ondersoek met behulp van histologiese studies. Die belangrikheid van ‘n geslote styl-kanaal vir weerstandbiedendheid teenoor FKV is bevestig in nege Suid-Afrikaanse inteellyne deur middel van skandeer elektron mikroskopie (SEM). Geen beduidende verwandskap tussen ‘n geslote styl-kanaal en die weerstandbiedenheid/vatbaarheid van die inteellyne voor bestuiwing is gevind nie, terwyl die kanaal in alle inteellyne gesluit was na bestuiwing. Die resultate dui daarop dat die styl-kanaal argitektuur nie ‘n noodsaaklike faktor is in die bepaling van weestand tot F. verticillioides besmetting in die suiwer mielielyne wat geselekteer was in hierdie studie nie. Verder is die moontlikheid dat weestand tot FKV en fumonisien kontaminasie geïnisieer kan word gedurende die saailing-fase ondersoek in beide ‘n weerstandbiedende en vatbare mielie inteellyn met behulp van konfokale laser skandering mikroskopie (CLSM). Die groei van F. verticillioides afkomstig vanuit die grond of saad is gemonitor in verskeie bo- en ondergrondse plantweefsels, maar geen beduidende verskille in kolonisasie kon opgespoor word tussen weerstandbiedende en vatbare mielie saailinge nie. Geen fumonisien produksie is waargeneem nie, ongeag die innokulasie metode of weerstand-status van die plant. Hierdie resultate dui daarop dat die weerstandbiedende en vatbare mielie saailinge wat in hierdie studie gebruik is moontlik nie weerstandbiedend is teen sistemiese swaminfeksie nie, maar wel weerstand kan bied tot afsetting van fumonisiene. Die weerstand geassosieër met die weerstandbiedende inteellyn word nie bemiddel gedurende die saailingfase nie maar waarskynlik deur strukturele en biochemiese verdedigingsmeganismes tydens latere plant ontwikkelings-stadia. / National Research Foundation (NRF)

Fusarium verticillioides è responsabile della fusariosi della spiga in mais e della contaminazione della granella con micotossine. Sono state individuate le regioni geniche e i geni candidati per la resistenza a Fusarium dal confronto tra una linea di mais resistente (CO441) e una suscettibile (CO354), impiegando tre diversi approcci: analisi QTL, analisi trascrittomica (RNASeq) e analisi metabolomica. 184 famiglie F2:3 (CO441xCO354) sono state valutate in due diversi ambienti nell’anno 2011 e inoculate artificialmente con due diverse tecniche (forchetta e stuzzicadente). E’ stata rilevata una significativa variazione genotipica in risposta all’infezione. Sulla base di una mappa preliminare di linkage molecolare contenente 74 marcatori microsatelliti polimorfici, sono stati determinati 8 QTLs comuni alla resistenza alla fusariosi della spiga e alla riduzione della contaminazione da fumonisine. Sono stati considerati geni candidati per la resistenza i geni differenzialmente espressi, risultanti dall’ RNASeq, in semi di mais CO441 prima e 72 ore dopo l’infezione. I metaboliti putativi correlati alla resistenza sono stati rilevati tramite high resolution LC-MS in entrambe le linee di mais. I geni candidati e i metaboliti mappano in pathway coinvolti nei meccanismi di difesa: fenilalanina, tirosina e triptofano biosintesi, fenilpropanoidi e flavonoidi biosintesi, metabolismo dell’acido linoleico e α-linolenico. Abbondanti trascritti derivano dalla biosintesi dei terpenoidi e dei diterpenoidi. Nei geni candidati verranno ricercati polimorfismi fra le due linee di mais e che andranno ad arricchire la mappa di linkage molecolare. / Fusarium verticillioides is responsible for Fusarium ear rot in maize and mycotoxin contamination of grain. Genomic regions and candidate genes for resistance to Fusarium were detected through the comparison of resistant (CO441) and susceptible (CO354) maize lines, by following three different approaches: Quantitative Trait Locus (QTL), transcriptomic (RNASeq) and metabolomic analyses. 184 F2:3 families (CO441xCO354) were evaluated in two different environments in 2011 and artificially infected with two side-needle inoculation methods (pin-bar and toothpick). Significant genotypic variation in response to infection was detected. On the basis of a genetic draft map containing 74 polymorphic SSRs markers, 8 common QTLs for Fusarium ear rot resistance and fumonisin contamination reduction were revealed. Candidate genes for resistance resulted from differentially expressed genes before and 72 hours post infection of CO441 kernels through RNASeq technology. Putative metabolites related to resistance were detected through high resolution LC-MS in both maize lines. Candidate genes and metabolites mapped in pathways involved in defense mechanism: phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis, linoleic and α-linolenic acid metabolism. Abundant genic transcripts derived from terpenoid and diterpenoid biosynthesis. Candidate genes will be screened for polymorphisms between the two maize lines in order to enrich the linkage map.

Phytopathogene <i>Fusarium</i> spp.treten weltweit in landwirtschaftlichen Kulturen auf und führen häufig zur Ertragsreduktion, Verschlechterung der Produktqualität sowie Kontaminationen der Erntegüter mit toxischen Sekundärmetaboliten, sog. Mykotoxinen. Die durch <i>Fusarium spp.</i> hervorgerufene partielle Taubährigkeit (FHB) des Weizens und anderer Getreidearten sowie die <i>Fusarium</i> Kolbenfäule an Mais sind aus ökonomischer Sicht von besonderer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verwendung von volatilen organischen Verbindungen (VOCs) zur Detektion von Fusariosen an Sommerweizen und Hybridmais unter Gewächshausbedingungen untersucht. Maiskolben wurden mit <i>F. graminearum</i>, <i>F. verticillioides</i> und <i>F. subglutinans</i> infiziert, während Weizenähren mit Sporensuspensionen von <i>F. graminearum</i>, <i>F. avenaceum</i> und <i>F. poae</i> inokuliert wurden. Auch Mischinfektionen wurden durchgeführt. Für die Sammlung der VOCs wurde ein statisches Verfahren (Festphasenmikroextraktion, SPME) sowie ein dynamisches Verfahren (open-loop stripping, OLS) eingesetzt. Die Analyse erfolgte in beiden Fällen mittels GC-MS. Ein nichtparametrischer Test (Kruskal-Wallis) wurde zur Identifikation von spezifischen volatilen Markern herangezogen. Auf diese Weise konnte an Mais ein Set aus 27 volatilen Biomarkern für die Infektion mit <i>Fusarium</i> spp. ermittelt werden. Die Kombination der VOCs ermöglichte hier die Unterscheidung zwischen Infektionen mit <i>F. graminearum</i> und <i>F. verticillioides</i>. An Weizen konnte ein Set aus 13 charakteristischen VOCs für den <i>Fusarium</i> Befall ermittelt werden. Die selektierten volatilen Marker beinhalteten sowohl einfache Moleküle mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen (C₅ - C₈), welche häufig von Pflanzen und Mikroorganismen emittiert werden, als auch infektionsspezifische Sesquiterpene (C₁₅H₂₄). In Zeitreihenversuchen konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der relevanten VOCs bereits nach kurzer Zeit emittiert wird. So waren in Mais volatile Biomarker detektierbar, bevor Symptome am Kolben erkennbar waren (4 – 8 Tage nach der Inokulation). Ein Monitoring von VOC Profilen im Hinblick auf volatile Marker könnte eine schnelle und nicht-destruktive Detektion von <i>Fusarium</i> Infektionen (ggf. auch Risikoabschätzung zur Mykotoxinbelastung), z.B. im Feld oder Lager, ermöglichen. Hierfür stehen transportable Detektoren zur Verfügung. Das makrozyklische Lacton Zearalenon (ZEN) wird von mehreren <i>Fusarium</i> spp. produziert und besitzt eine östrogene Wirkung auf den menschlichen und tierischen Organismus. Schweine gelten diesbezüglich als besonders anfällig. ZEN wird in gemäßigten Klimazonen regelmäßig in Lebens- und Futtermitteln nachgewiesen. Bislang wurden zahlreiche Bioassays für die Detektion von ZEN beschrieben. Sie basieren meist auf den menschlichen Östrogenrezeptoren α und β und reagieren unspezifisch auf eine Vielzahl von östrogenen Substanzen (z.B. Genistein, 17β-Estradiol). Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig ein Bioassay zur spezifischen Detektion von ZEN sowie dem kritischen Metabolit α-Zearalenol (α-ZOL). Das Assay basiert auf einer <i>zes2::gfp</i> Mutante des Mykoparasiten <i>Gliocladium roseum</i> und ermöglicht eine Detektion von ZEN in Feldproben (z.B. kontaminierter Mais). Schritte zur Probenvorbereitung und Extraktion, einschließlich Aufreinigung mit Immunoaffinitätssäulen, sowie die Kultur des Inditaktorstammes wurden optimiert. Das Assay eignet sich für die qualitative Detektion von ZEN in einem weiten Konzentrationsbereich sowie für eine quantitative ZEN Bestimmung in kontaminierten Mais Feldproben im Bereich zwischen 0,9 mg kg^-1 und 90 mg kg^-1. Neben der Detektion in Feldproben, konnte das Bioassay erfolgreich für ein Screening von Pilzstämmen zur Identifikation von ZEN-Produzenten eingesetzt werden. Das hier beschriebene <i>G. roseum zes2::gfp</i> Bioassay kann mit einer einfachen Laborausstattung durchgeführt werden und eignet sich möglicherweise für die Anwendung in Entwicklungsländern.

E’ stata approfondita l’espressione genica complessiva in spighe di mais, in seguito all’ infezione fungina. Nella prima parte del lavoro, sono stati valutati un genotipo di mais resistente ed uno suscettibile a F. verticillioides, campionando le cariossidi 48 ore dopo l’infezione. Sono state identificate circa 800 sequenze differenzialmente espresse e circa il 10% è stato assegnato alla categoria della difesa. Nel genotipo resistente, i geni coinvolti nella difesa hanno mostrato un tipo di risposta basale, mentre in quello suscettibile tali geni rispondevano specificamente all’infezione. Nella seconda parte del lavoro, l’analisi di espressione è stata estesa a fasi precoci e tardive dell’infezione utilizzando un ceppo normale ed uno mutante di F. verticillioides. Numerosi geni risultavano differenzialmente regolati 48 ore dopo l’infezione con entrambi i ceppi. Il ceppo normale era in grado di attivare i meccanismi di difesa prima del mutante. Nella terza parte del lavoro, 10 linee resistenti e suscettibili sono state infettate con 4 specie fungine. In tutti i genotipi l’espressione dei geni coinvolti nella difesa era indotta in seguito all’infezione, ma le linee resistenti presentavano una risposta basale di difesa. / We investigated global gene expression in maize ears at several time points after fungal infection. In the first part of the work, resistant and susceptible genotypes were tested in kernels sampled 48 h after infection with a wild type strain of F. verticillioides. About 800 differentially expressed sequences were identified and nearly 10% assigned to the category cell rescue, defense and virulence. In the resistant genotype, defense-related genes provided basic defense against the fungus, while in the susceptible genotype defense genes responded specifically to pathogen infection. In the second part of the work the expression analysis was extended to early and late phases of infection with a wild type and a mutant strains of F. verticillioides. Kernels were sampled in the area around the point of infection. Most of genes were differentially regulated 48 h after infection with both fungal strains. The wild type strain was able to activate host defense genes before the mutant strain. In the third part of the work, ten resistant and susceptible lines were infected by different fungal species. All genotypes were able to induce the expression of defense genes upon infection, but the resistant lines showed a basal defense response.