La migration des cellules endothéliales est une des étapes nécessaires à l'angiogenèse physiologique et tumorale. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la kinase de stress SAPK2/p38 via le récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR-2. Nous avons étudié les événements moléculaires suivant l'activation du récepteur du VEGF et menant à l'activation de la voie SAPK2/p38 dans les cellules endothéliales. La tyrosine 1214 en C-terminal du VEGFR-2 est un site majeur d'autophosphorylation nécessaire à l'activation de SAPK2/p38 par le VEGF dans les cellules endothéliales. Le résidu phospho-tyrosine 1214 permet le recrutement de la protéine adaptatrice Nck via son domaine SH2. De plus, l'activation de Fyn, une kinase de la famille Src, mais non c-Src même, dépend de la phosphorylation de la tyrosine 1214. L'utilisation d'un dominant négatif de Fyn empêche l'activation de SAPK2/p38, inhibe la formation de fibres de tension et abolit la migration endothéliale. Nck et Fyn s'associent en réponse au VEGF et l'activité de Fyn est nécessaire à la phosphorylation sur tyrosine de Nck et de la kinase PAK-2. La formation de fibres de tension nécessite aussi l'activation de la petite GTPase Cdc42, ce qui permet d'acheminer le signal du VEGF vers SAPK2/p38, sa cible physiologique MAPKAP K2, puis vers l'actine. Ces résultats suggèrent une séquence d'étapes moléculaires précoces suivant l'activation du VEGFR-2 et régulant la dynamique d'actine nécessaire à la migration endothéliale. 11 s'agit de la première description d'une séquence d'événements couplant l'activation d'un récepteur à activité tyrosine kinase à celle d'une kinase de stress. Par ailleurs, l'identification du rôle du site tyrosine 1214 du VEGFR-2 en fait une cible précise pour le développement d'une drogue anti-angiogénique. / Endothelial cell migration is one major step of physiological and pathological angiogenesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent regulator of angiogenesis and induces actin reorganization into stess fibers and cell migration via activation of SAPK2/p38 downstream of the tyrosine kinase receptor VEGFR-2. We studied the molecular events following the activation of the VEGF-receptor that lead to the activation of the SAPK2/p38 pathway in endothelial cells. The tyrosine 1214 residue in C-terminal of the VEGFR-2 is a major autophosphorylation site that is required for the activation of SAPK2/p38 by VEGF in endothelial cells. The adaptor protein Nck is recruited to the phospho-tyrosine 1214 residue via its SH2 domain. Moreover, the activation of the Src-family kinase Fyn, but not c-Src itself, depends on phospho-tyrosine 1214. A dominant negative form of Fyn inhibits SAPK2/p38 activation, stress fibers formation and endothelial cell migration. Nck and Fyn associate in response to VEGF and Fyn activity is required for the tyrosine-phosphorylation of Nck and PAK-2. The activation of the small Rho GTPase Cdc42 downstream of tyrosine 1214 is also required for the activation of SAPK2/p38, its physiological target MAPKAP K2, and stress fiber formation. Altogether, these results suggest a sequence of early molecular steps following VEGFR-2 activation by VEGF that regulate the actin dynamics required for endothelial cell migration. This is the first description of a sequence of events that couple the activation of a tyrosine kinase receptor to that of a stress-activated kinase. The identification of the role of the tyrosine 1214 residue on VEGFR-2 makes it an appealing target for the development of an anti-angiogenic therapy.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus de type 2 induit un mécanisme de mort cellulaire alternatif indépendant des caspases et qui résiste à l'oncogène Bcl-2. E4orf4 constitue donc un outil moléculaire puissant pour étudier de nouveaux effecteurs impliqués dans la mort cellulaire. À mon arrivée dans le laboratoire, il avait été démontré qu'E4orf4 usurpait l'activité des tyrosine kinases de la famille Src afin de réorganiser le cytosquelette d'actine et que ce processus était corrélé avec son activité cytotoxique. Par contre, la nature des modifications de la dynamique de l'actine ainsi que le mécanisme moléculaire impliqué étaient inconnus. L'hypothèse à la base de mes travaux est qu'E4orf4 désorganise le réseau d'actine en manipulant l'activité des Rho GTPases et que le débalancement de la dynamique de l'actine qui en résulte engage la cellule dans un programme de mort cellulaire alternatif. Mes travaux indiquent qu'E4orf4 active le sentier Src-RhoA-ROCK, ce qui stimule la contractilité cellulaire en activant la myosine II. L'activité de cette dernière est essentielle, car son inhibition bloque le programme de mort cellulaire induit par E4orf4. Par conséquent, mes travaux ont contribué à établir un lien fonctionnel entre la dynamique de l'actine et la mort cellulaire. De plus, mes résultats indiquent que la stimulation du sentier Src-RhoA -ROCK par E4orf4 contribue à activer la MAP kinase JNK qui est nécessaire pour phosphoryler la sérine 178 de paxilline. Mes résultats montrent que la phosphorylation de cette sérine de paxilline diminue sa mobilité, contribuant ainsi à stabiliser les plaques d'adhérence en aval d'E4orf4. En outre, la phosphorylation de la sérine 178 de paxilline est essentielle à l'activité cytotoxique d'E4orf4, car son iphibition interfère avec la réorganisaton du cytosquelette d'actine et la condensation nucléaire induites par E4orf4. Ainsi, mes travaux suggèrent que JNK coopère avec la myosine II pour perturber la dynamique de l'adhérence et de l'actine en aval d'E4orf4. En conséquence, je propose qu'E4orf4 induit l'axe de signalisation Src-RhoA-ROCK pour générer un stress mécanique via la coordination des dynamiques de l'adhérence et de l'actine qui culmine par la mort programmée de la cellule.

Les cellules neuroendocrines sécrètent hormones et neuropeptides dans la circulation sanguine par un processus d’exocytose régulée par le calcium. Engendrant un apport de membrane important à la surface cellulaire, l'exocytose doit être suivie par un processus d’endocytose compensatrice afin de maintenir l’homéostasie cellulaire et assurer le recyclage des composés vésiculaires. La connaissance précise des mécanismes moléculaires qui régulent la sécrétion neuroendocrine est primordiale. En effet, de nombreux cancers neuroendocrines sont associés à un dysfonctionnement de la sécrétion hormonale. Bien que connus des cliniciens, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui induisent de telles perturbations de sécrétion restent à ce jour inexplorés. Les travaux réalisés au laboratoire démontrent que la sécrétion hormonale dans les cellules neuroendocrines est contrôlée par RhoA, Rac1 et Cdc42, trois GTPases de la famille Rho. Néanmoins, les voies moléculaires contrôlant le cycle d’activation-inactivation de ces GTPases Rho lors de l’exocytose sont peu connues. Mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux. Un premier objectif fut d’étudier, au cours de la sécrétion neuroendocrine, l’implication potentielle de l’oligophrénine-1, une protéine GAP capable d'inactiver certaines GTPases Rho. En utilisant les cellules chromaffines de la glande surrénale comme modèle cellulaire, j'ai découvert un double rôle de la protéine oligophrénine-1. En effet, en inactivant RhoA, l’oligophrénine-1 permettrait la mise en place du pore de fusion nécessaire à l'exocytose tandis que par le biais de son domaine BAR, elle contrôle l'endocytose compensatrice. Mon second objectif fut d’appréhender les bases cellulaires et moléculaires à l’origine du dysfonctionnement de la sécrétion dans les cancers neuroendocrines en utilisant les phéochromocytomes humains comme modèle expérimental. En combinant des analyses ampérométriques et protéomiques sur des tumeurs humaines, j'ai pu montrer que l'hypersécrétion catécholaminergique des phéochromocytomes est bien la conséquence d’une augmentation de l’activité sécrétrice. J'ai également pu identifier des acteurs protéiques, dont plusieurs modulateurs des GTPases de type Rho, qui pourraient être impliqués dans ces défauts de sécrétion. L’ensemble de mon projet de thèse m’a permis de mieux comprendre les mécanismes de régulation des GTPases Rho au cours de la sécrétion mais également de proposer les premières bases moléculaires et cellulaires abordant les perturbations de la sécrétion dans les tumeurs neuroendocrines. / Neuroendocrine cells release hormones and neuropeptides in the bloodstream through a calcium regulated exocytosis process. This process leads to an important increase of membrane at the cell surface which needs to be compensated through endocytosis in order to maintain cell homeostasis as well as the recycling of vesicular compounds. Many neuroendocrine cancers have been associated with a dysfunction in hormone secretion, urging toward a need to understand the molecular mechanisms which regulate neuroendocrine secretion. Even though these perturbations are known at a clinical level, the underlying cellular and molecular mechanism remains to be unraveled. Previous works in the team demonstrate that hormone secretion is regulated by RhoA, Rac1 and Cdc42, which are all GTPases of the Rho family. Nevertheless the molecular pathways which control the activation and inactivation cycle of these RhoGTPases during exocytosis remain unknown. My PhD project covered essentially two aspects. My first goal was to characterize the potential role of oligophrenin-1, a GAP protein which can inactivate Rho-GTPases, in neuroendocrine secretion. By using adrenal gland chromaffin cells as a cellular model, I have discovered a dual role for oligophrenin-1. Indeed, through RhoA inactivation, oligophrenin-1 allows the set up of a fusion pore, which is necessary for exocytosis, while controlling through the BAR domain the compensatory endocytosis. My second goal was to characterize the molecular and cellular basis which leads to a secretion dysfunction in neuroendocrine cancers by using human pheochromocytomas as an experimental model. By combining amperometric and proteomic analyses on human tumors, I was able to demonstrate that pheochromocytoma catecholaminergic secretion was indeed due to an increase in secretion activity. I could also identify major actors, including several Rho GTPase modulators, which could be implied in these secretion defects. All together, these approaches gave me a better understanding of RhoGTPase regulation during secretion but also an insight into the molecular and cellular basis of impaired secretion in neuroendocrine tumors.