Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2281509 bytes, checksum: 8e44475ccbcd12f91301ea5e4fda8830 (MD5) Previous issue date: 2013-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Plants are engaged in a continuous co-evolutionary struggle for dominance with their pathogens and the outcomes of these interactions are of particular importance to human activities, as they can have dramatic effects on agricultural systems (Dodds & Rathjen, 2010). Recently, the convergence of molecular studies of plant immunity and pathogen infection strategies is revealing an integrated picture of the plant pathogen interaction (Mukhtar et al., 2011) in which the pathogen effectors interaction converge onto highly connected subgroups of proteins, named hubs. A well-defined hub form plant immune system network corresponds to CSN5A protein, a catalytic subunit of the COP9 signalosome acting as a key regulator in several basic cellular processes. Consistent with the prediction that different effectors from different pathogens target similar connections in plant-pathogen interaction network, it has been shown, independently, that the protein C2 from geminivirus, a DNA virus that infects a wide variety of agronomic crops, interacts to CNS5A (Lozano- Duran et al, 2011). Additionally, it was shown that NIG and the immune receptor NIK, both targets of geminivírus NSP, interact to CSN5A (Machado, 2011; Mukhtar et al., 2011). Based on this information, it is expected that the hub CNS5A is a functional element in the geminivirus-host interaction network. Recently, it was reported that NIG, a cellular partner of CSN5A, also interacts with a unknown function protein, encoded by the locus AT2G41020 in yeast (Machado, 2011). As a possible component from geminivirus-host interaction network converging to CSN5A, AT2G41020 may interact directly or indirectly with virulence factors in defense response or compatibility. The objectives of this research involved biochemical characterization of the protein encoded by the locus AT2G4102, designated AtWWP1, and identification of its possible interactions with viral proteins and host factors. In silico analysis of tWWP1 predicted structure revealed the presence of two WW domains, and a C-terminal domain highly conserved between homologous in plant and animals. Furthermore, it has been shown that AtWWP1 is a nuclear protein capable of forming nuclear bodies via the conserved C-terminal domain. Coimmunoprecipitation and BiFC assays demonstrated that AtWWP1 interacts in vivo with the cytoplasmic protein NIG, redirecting it to nuclear bodies. In order to explore the formative activity of nuclear bodies AtWWP1, the interaction between AtWWP1 and a second protein partner AtMBD2 (methyl CG binding domaincontaining protein) was characterized in vivo. The ability to form nuclear bodies as interaction with AtMBD2 were mapped AtWWP1 occuring via its domain and C-terminal conserved, substantiating the argument that this region of AtWWP1 is responsible for the formation of nuclear bodies. Colocalization assays have shown that nuclear bodies contained in AtWWP1 are distinct from those formed by proteins involved in RNA splicing, but colocalized with nuclear bodies containing CDKC2. Furthermore, it was demonstrated that AtWWP1 does not bind to RNA, but exhibits a binding activity to DNA. These characteristics imply that AtWWP1 should be involved with basic nuclear functions. As a component of a functional hub in geminivirus-host interaction network, it is important to assess whether the viral infection would affect the nuclear bodies formed by AtWWP1. / Estudos moleculares envolvendo o sistema imune de plantas e a infecção por patógenos revelaram um panomara integrado de interações plantapatógeno em que as interações dos efetores de virulência convergem para subconjuntos de proteínas do hospedeiro altamente interconectadas e designadas hubs. Um hub funcional e bem definido do sistema imune de plantas corresponde a interconexões convergentes para a proteína CNS5A que constitui a subunidade catalítica do complexo COP9 signalosome, um regulador chave de diversos processos celulares básicos. Consistente com a previsão de que efetores de diferentes patógenos devem alvejar similares conexões na rede de interações planta-patógeno, foi demonstrado, independentemente, que a proteína C2 de geminivírus, um vírus de DNA que infecta uma grande variedade de culturas agronômicas, interage com a proteína CNS5A. Além disso, foi também demonstrado que tanto a proteína NIG, quanto o receptor imune NIK, ambos alvos da proteína NSP de geminivírus, também interagem com CNS5A. Baseado nestas informações, prevê-se que a interconexão (hub) representada por CNS5A seja um elemento funcional na interação geminivírus-hospedeiro. Recentemente, foi identificado que, além de interagir com CSN5A, a proteína NIG também interage com uma proteína de função desconhecida codificada pelo locus AT2G41020, em leveduras . Como possível componente da rede de interações geminivírus-hospedeiro que converge em CNS5A, AT2G41020 pode interagir direta ou indiretamente com fatores de virulência em resposta de defesa ou de compatibilidade. Sendo assim, os objetivos principais dessa investigação envolveram caracterização bioquímica da proteína codificada pelo locus AT2G41020 e identificação de possíveis interações com proteínas virais e fatores do hospedeiro. Análise in silico da estrutura predita da proteína codificada pelo lócus At2G41020, designada AtWWP1, revelou a presença de dois domínios WW e um domínio C-terminal altamente conservado entre proteínas homólogas de espécies vegetais e animais. Além disso, foi demonstrado que a proteína AtWWP1 é uma proteína nuclear capaz de formar corpos subnucleares via o domínio C-terminal conservado. Ensaios de coimunoprecipitação e BiFC demonstraram que AtWWP1 interage in vivo com a proteína citoplasmática NIG promovendo o seu redirecionamento para corpos nucleares. Com a finalidade de explorar a atividade formadora de corpos nucleares de AtWWP1, a interação entre AtWWP1 e uma segunda proteína parceira AtMBD2 (proteína contendo um domínio de interação com CG metilado) foi caracterizada in vivo. Tanto a capacidade de formar corpos nucleares quanto a interação com AtMBD2 foram mapeadas em AtWWP1 e ocorrem via seu domíno C-terminal conservado, substanciando o argumento de que esta região de AtWWP1 é responsável pela formação de corpos subnucleares. Ensaios de co-localização demonstraram que os corpos nucleares contidos em AtWWP1 são distintos daqueles formados por proteínas envolvidas em splicing do RNA; porém co-localizam com corpos nucleares contendo CDKC2. Além disso, foi demonstrado que AtWWP1 não liga a RNA, mas exibe uma atividade de ligação ao DNA. Estas características implicam que AtWWP1 deve estar envolvida com funções nucleares básicas. Como componente de um hub funcional na interação geminivírus-hospedeiro, torna-se relevante avaliar se a infecção viral afetaria os corpos nucleares formados por AtWWP1.