Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T12:25:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T12:38:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_AssmaaElKhal.pdf: 1644167 bytes, checksum: 7bb691d3e4aacbab44aea2489c898875 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / O crescente surgimento de resistência bacteriana aos antibióticos convencionais é um grave problema que precisa ser enfrentado, seja pela descoberta de novas substâncias antimicrobianas, naturais ou sintéticas, ou através da pesquisa de terapias alternativas que sejam economicamente acessíveis. A terapia de fagos é uma dessas alternativas. Trata-se de uma forma de controle biológico, baseado em vírus específicos que infectam e destroem células bacterianas: os bacteriófagos. No entanto, esta é uma fonte terapêutica ainda pouco explorada. Esse trabalho utilizou o cultivo, isolamento e sequenciamento do genoma, além de técnicas de genômica de alto desempenho para isolar e caracterizar o genoma de bacteriófagos específicos para a linhagem enteroinvasiva de Escherichia coli ATCC 43893, visando o entendimento e a definição do ciclo de infecção desses vírus (líticos ou lisogênicos). A metodologia utilizada nessa pesquisa possibilitou o isolamento de 12 vírus. 8 diferentes linhagens virais tiveram seu material genético extraído e purificado, apresentando bom rendimento e quantidade reduzida de DNA bacteriano contaminante. O sequenciamento do genoma desses 8 vírus foi realizado usando a plataforma de nova geração MiSeq. Foi analisada a diversidade genética desses bacteriófagos e verificou-se que são vírus da ordem Caudovirales, sendo 2 da família Siphoviridae e 6 da família Myoviridae. Apenas um deles mostrou potencial de ter ciclo lisogênico, os outros sete vírus não continham nenhum gene que sugerisse isso. Entretanto, apesar dos bacteriófagos isolados não terem apresentado genes relacionados ao ciclo lisogênico, análises mais aprofundadas devem ser realizadas para comprovar que são realmente exclusivamente líticos, já que muitos não apresentam seu genoma completo e mais de 50% dos genes anotados não têm função definida. / serious problem that needs to be faced, either through the discovery of new antimicrobial substances, natural or synthetic, or by searching for alternative therapies that are affordable. The phage therapy is one of those alternatives. It is a form of biological control based on specific viruses that infect and kill bacterial cells: the bacteriophages. However, this therapeutic source is still poorly explored. This study used the cultivation, isolation and sequencing of the genome, as well as high-performance genomic techniques to isolate and characterize the genome of specific bacteriophages for enteroinvasive Escherichia coli ATCC 43893, for the understanding and the definition of the infection cycle (lytic or lysogenic) of these viruses. The methodology used in this study allowed the isolation of 12 viruses. 8 different viral strains had their genetic material extracted and purified, with good yield and reduced amount of contaminating bacterial DNA. The sequencing of the genome of these 8 viruses was conducted using the new generation MiSeq platform. The the genetical diversity of these bacteriophages was analyzed and it was found that the viruses belong to the Caudovirales order, which 2 belong to the Siphoviridae family and 6 to the Myoviridae family. Only one of them showed the potential to have lysogenic cycle, the other seven viruses contained no gene to suggest that. However, despite the isolated bacteriophages have not presented genes related to lysogenic cycle, further analysis should be conducted to demonstrate that they are really exclusively lytic, since many do not have their genome completed and more than 50% of the annotated genes have no defined function.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desde a década de 1990, os esforços internacionais para a obtenção de genomas completos levaram à determinação do genoma de inúmeros organismos. Isto, aliado ao grande avanço da computação, tem permitido o uso de abordagens inovadoras no estudo da estrutura, organização e evolução dos genomas e na predição e classificação funcional de genes. Entre os métodos mais comumente empregados nestas análises está a busca por similaridades entre sequências biológicas. Análises comparativas entre genomas completamente sequenciados indicam que cada grupo taxonômico estudado até o momento contém de 10 a 20% de genes sem homólogos reconhecíveis em outras espécies. Acredita-se que estes genes taxonomicamente restritos (TRGs) tenham um papel importante na adaptação a nichos ecológicos particulares, podendo estar envolvidos em importantes processos evolutivos. Entretanto, seu reconhecimento não é simples, sendo necessário distingui-los de ORFs não-funcionais espúrias e/ou artefatos derivados dos processos de anotação gênica. Além disso, genes espécie- ou gêneroespecíficos podem representar uma oportunidade para o desenvolvimento de métodos de identificação e/ou tipagem, tarefa relativamente complicada no caso dos procariotos, onde o método padrão-ouro na atualidade envolve a análise de um grupo de vários genes (MultiLocus Sequence Typing MLST). Neste trabalho utilizamos dados produzidos através de análises comparativas de genomas e de sequências para identificar e caracterizar genes espécie- e gênero-específicos, os quais possam auxiliar no desenvolvimento de novos métodos para identificação e/ou tipagem, além de poderem lançar luz em importantes processos evolutivos (tais como a perda e ou origem de genes em linhagens particulares, bem como a expansão de famílias de genes em linhagens específicas) nos organismos estudados. / Since the 1990s, international efforts to obtain complete genomes led to the determination of the genome of many organisms. This, coupled with great advances in computing, has allowed the use of innovative approaches in the study of structure, organization and evolution of genomes and the prediction and functional classification of genes. Among the methods most commonly employed in such analysis is the search for similarities between biological sequences. Comparative analysis of whole genome sequences indicate that each taxonomic group studied so far contain 10 to 20% of genes with no recognizable homologues in other species. It is believed that these taxonomically restricted genes (TRGs) have an important role in adaptation to particular ecological niches and may be involved in important evolutionary processes. However, the recognition of such genes is not simple, being necessary to distinguish them from spurious ORFs nonfunctional and / or artifacts from the processes of gene annotation. Furthermore, species- or genus-specific genes may be an opportunity for the development of methods for identification and / or typing, a relatively complicated task in the case of prokaryotes, where the gold standard at present involves the analysis of a group of several genes (Multilocus Sequence Typing - MLST). This study used data generated through comparative analysis of genome sequences to identify and characterize species- and genusspecific genes, which may help in the development of new methods for identification and / or typing, and can possibly shed light on important evolutionary processes (such as loss and / or origin of genes in particular lineages, as well as expansion of gene families in specific strains) involving the studied organisms.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desde a década de 1990, os esforços internacionais para a obtenção de genomas completos levaram à determinação do genoma de inúmeros organismos. Isto, aliado ao grande avanço da computação, tem permitido o uso de abordagens inovadoras no estudo da estrutura, organização e evolução dos genomas e na predição e classificação funcional de genes. Entre os métodos mais comumente empregados nestas análises está a busca por similaridades entre sequências biológicas. Análises comparativas entre genomas completamente sequenciados indicam que cada grupo taxonômico estudado até o momento contém de 10 a 20% de genes sem homólogos reconhecíveis em outras espécies. Acredita-se que estes genes taxonomicamente restritos (TRGs) tenham um papel importante na adaptação a nichos ecológicos particulares, podendo estar envolvidos em importantes processos evolutivos. Entretanto, seu reconhecimento não é simples, sendo necessário distingui-los de ORFs não-funcionais espúrias e/ou artefatos derivados dos processos de anotação gênica. Além disso, genes espécie- ou gêneroespecíficos podem representar uma oportunidade para o desenvolvimento de métodos de identificação e/ou tipagem, tarefa relativamente complicada no caso dos procariotos, onde o método padrão-ouro na atualidade envolve a análise de um grupo de vários genes (MultiLocus Sequence Typing MLST). Neste trabalho utilizamos dados produzidos através de análises comparativas de genomas e de sequências para identificar e caracterizar genes espécie- e gênero-específicos, os quais possam auxiliar no desenvolvimento de novos métodos para identificação e/ou tipagem, além de poderem lançar luz em importantes processos evolutivos (tais como a perda e ou origem de genes em linhagens particulares, bem como a expansão de famílias de genes em linhagens específicas) nos organismos estudados. / Since the 1990s, international efforts to obtain complete genomes led to the determination of the genome of many organisms. This, coupled with great advances in computing, has allowed the use of innovative approaches in the study of structure, organization and evolution of genomes and the prediction and functional classification of genes. Among the methods most commonly employed in such analysis is the search for similarities between biological sequences. Comparative analysis of whole genome sequences indicate that each taxonomic group studied so far contain 10 to 20% of genes with no recognizable homologues in other species. It is believed that these taxonomically restricted genes (TRGs) have an important role in adaptation to particular ecological niches and may be involved in important evolutionary processes. However, the recognition of such genes is not simple, being necessary to distinguish them from spurious ORFs nonfunctional and / or artifacts from the processes of gene annotation. Furthermore, species- or genus-specific genes may be an opportunity for the development of methods for identification and / or typing, a relatively complicated task in the case of prokaryotes, where the gold standard at present involves the analysis of a group of several genes (Multilocus Sequence Typing - MLST). This study used data generated through comparative analysis of genome sequences to identify and characterize species- and genusspecific genes, which may help in the development of new methods for identification and / or typing, and can possibly shed light on important evolutionary processes (such as loss and / or origin of genes in particular lineages, as well as expansion of gene families in specific strains) involving the studied organisms.