Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-06-28T18:01:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) AnaPavla_Tese.pdf: 2030041 bytes, checksum: d62d754a4e28b637ecec9ecbd30a1fb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T18:01:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) AnaPavla_Tese.pdf: 2030041 bytes, checksum: d62d754a4e28b637ecec9ecbd30a1fb2 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / CAPES / Cerca de 265 mil mulheres morrem todos os anos vítimas de câncer cervical. Infecções persistentes causadas por Papilomavírus humano de alto risco oncogênico (HR HPVs) é uma condição necessária, porém não suficiente para o desenvolvimento de lesões cervicais e câncer cervical. Dessa forma, diversos fatores ambientais e genéticos estão envolvidos na carcinogênese cervical. Dentre os fatores genéticos, as variantes genéticas dos HR HPVs parecem estar relacionados com o risco de infecções persistentes e desenvolvimento de lesões e câncer cervical. Assim, o presente estudo investigou: 1) A variabilidade genética de um fragmento do gene L1 dos HPV16, 31, 53, 54, 56, 58, 61, 62, 66, 70 e 81 em amostras biológicas de pacientes oriundos dos Estados de Pernambuco, Alagoas e Sergipe, Nordeste do Brasil; 2) A variabilidade genética da LCR dos HR HPVs 16, 31 e 58 oriundas de pacientes dos Estados de Pernambuco, Alagoas e Sergipe, Nordeste do Brasil; 3) Uma possível associação entre os polimorfismos virais do gene L1 e o risco para desenvolver lesões cervicais nas pacientes do Nordeste do Brasil. Para tanto, a detecção do DNA viral foi realizada em amostras biológicas de 784 pacientes. Os fragmentos parciais do gene L1 e da LCR dos HPVs mencionados foram sequenciados. Análises in silico de possíveis epitopos de células B e de células T foram efetuadas nas regiões de mutação não-sinônima no gene L1. Além disso, análises in silico dos sítios de ligação dos fatores transcricionais foram realizadas em regiões de alteração nucleotídica da LCR. Foram detectados 23 tipos de HPVs: HPVs 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 54, 56, 58, 61, 62, 66, 70, 72, 81, 82, 83 e 84. Com relação ao gene L1 dos HPV analisados, foram detectadas 98 mutações, sendo 96/98 substituições de bases, 1/98 deleção e 1/98 inserção de nucleotídeo. Dentre estas alterações nucleotídicas no gene L1, 29,6% são mutações não sinônimas. Ademais, 18,36% das variações detectadas no gene L1 estavam inseridas em epitopos de células B, 25,5% inseridos em regiões de MHC Classe I e 18,36% inseridos em regiões de MHC Classe II. Um total de 8,1% das variações genéticas observadas no gene L1 dos HPV estudados foram descritos pela primeira vez na literatura. Em relação a LCR, foram detectadas 95 mutações, sendo 88/95 substituições de bases, 5/98 deleções e 2/95 inserções de nucleotídeos. Um total de 51,5% das mutações detectadas estão inseridas em sítios de ligação dos fatores transcricional celular e/ou viral. Além disso, 3,1% das variações genéticas encontradas na LCR foram descritas pela primeira vez na literatura. As análises filogenéticas mostraram a presença das variantes A e D do HPV16, A e C do HPV31 e A, B, C e D do HPV58 circulante no Nordeste do Brasil. Com relação a repercussão biológica das mutações do gene L1 do HPV16, não foram observadas associações significativas (p>0.05) entre os polimorfismos do gene L1 e o risco para desenvolver lesões cervicais. Entretanto, a combinação de determinados alelos destes polimorfismos virais está fortemente associada com o risco de desenvolver lesão cervical. Assim, a detecção das principais variantes e de alterações nucleotídicas com potencial impacto biológico circulantes no Nordeste Brasileiro é importante face as diferenças na patogenicidade dos HPVs. / Approximately 265 thousand women die every year from cervical cancer. Persistent infections caused by high oncogenic risk Human papillomavirus (HR HPV) are necessary but not sufficient condition for the development of cervical lesions and cervical cancer. Therefore, several environmental and genetic factors are involved in cervical carcinogenesis. Concerning the genetic factors, variants of HR HPV seem to be related to the risk of persistent infections and the development of lesions and cervical cancer. In this sense, the present study aimed to investigate: 1) The genetic variability of a L1 gene fragment from HPV16, 31, 53, 54, 56, 58, 61, 62, 66, 70 and 81 in biological samples of patients from Pernambuco, Alagoas and Sergipe states, Northeastern Brazil; 2) The genetic variability of the LCR of HR HPVs 16, 31 and 58 of patients from from Pernambuco, Alagoas and Sergipe states, Northeastern Brazil; 3) Possible association between the viral polymorphisms of the L1 gene and the risk to develop cervical lesions in patients from the Brazilian Northeast. To achieve that, viral DNA detection was performed in biological samples from 784 patients. Partial fragments of the L1 gene and the LCR of the abovementioned HPVs were sequenced. In silico predictions of possible B cells and T cells epitopes were performed in regions of non-synonymous mutation of the L1 gene. Moreover, in silico predictions of the binding sites of transcriptional factors were performed in nucleotide change regions within LCR. Twenty-three HPV types were detected: HPVs 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 54, 56, 58, 61, 62, 66, 70, 72, 81, 82, 83 e 84. Regarding the L1 gene from the analyzed HPVs, 98 mutations were detected, in which 96 are nucleotide substitutions, 1 is deletion and 1 is nucleotide insertion. Among these nucleotide changes in the L1 gene, 29.6% are non-synonymous mutations. Moreover, 18.36% of the nucleotide changes are located in B cell epitopes, 25.5% located in MHC Class I regions and 18.36% located in MHC Class II regions. Finally, 8.1% of the genetic variations in the L1 gene of the studied HPVs were observed for the first time. Concerning LCR, 95 mutations were detected, in which 88 are nucleotide substitutions, 5 are deletions and 2 are nucleotide insertions. A total of 51.5% of the detected mutations are located in binding sites of cellular and/or viral transcriptional factors. Additionally, 3.1% of the genetic variations found in LCR were described for the first time. Phylogenetic analisys showed the presence of A and D variants of the HPV16, A and C variants of the HPV31, and A, B, C and D variants of the HPV58 circulating in the Brazilian Northeast. In regard to the biological repercussion of the L1 gene mutations of the HPV16, no significant associations were observed (p>0.05) between L1 gene polymorphism and the risk to develop cervical lesions. However, the combination of certain alleles from these viral polymorphisms is firmly associated to the risk to develop cervical lesion. Thus, the detection of the main circulating variants with potential biological impact in the Brazilian Northeast is important in view of the differences in the pathogenicity of the HPV.

The Human Papillomavirus (HPV) is a virus of the Papillomaviridae family and its genome consists of DNA. It is the main cause of viral sexual transmission. Cervical cancer or uterine colon cancer is the second most common occurrence among women worldwide. Recent studies have proven that some types of HPV are mainly responsible for the development of this type of cancer. In accordance to its oncogenic activity this viral group was divided in low and high risk types. Brazil does not have a representative amount of data related to the prevalence of HPV infection. The incidence data of the virus is obtained through the analysis of carriers of the invasive carcinoma of uterine colon, cervical intraepithelial neoplasias, and others types of infections associated. Molecular assays have been showing throughout the years an excellent sensitivity and specificity in the detection of the HPV s DNA. Nowadays, in situ hybridization techniques are being used as method of choice for the detection of the viral DNA. In many studies, the Polymerase Chain Reaction (PCR) with the application of the primers MY09 and MY11 have shown efficiency in viral tracking, consequently, the development of molecular diagnostics allow monitoring of the disease, decreasing mortality rates caused by cancer of the cervix. The DNA sequencing is an efficient methodology used for the molecular characterization of the viral types, which allows the accomplishment of the alignment for similarity of the sequences obtained through others that were already identified and deposited in the GenBank. The current study s purpose was to identify the different types of HPV and the presence of co-infections through PCR and sequencing of a hyper-variable region of the L1 gene. The studied sample consisted of 515 female volunteers, which 111 (21.55%) presented the incidence of the HPV DNA. Within the acquired specimens, 50% were considered high oncogenic risk (the major incidence was types 16 and 58) and 7.21% had multiple infection. The determination of the base sequencing of the L1 gene is essential to the identification of the viral type. However, the sequencing of the complete gene and both DNA chains become financially unviable for the majority of the specialized laboratories. A practical approach applied in this study was to determine the sequencing of a specific region of the L1 gene with 450pb, where the identification of the HPV became possible by following this methodology. The techniques used showed the necessity of the application of a more sensible and specific viral diagnosis, which contributes to the viral infection control and to the reduction of the mortality rate caused by cervical cancer. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O Papilomavírus Humano (HPV) é um vírus da família Papillomaviridae e possui o seu genoma constituído de DNA. É o causador da transmissão sexual viral de maior frequência. O câncer cervical ou câncer de colo de útero possui a segunda maior ocorrência nas mulheres de todo o mundo. Estudos recentes têm comprovado que alguns tipos de HPV são os principais responsáveis pelo desenvolvimento deste tipo de câncer. De acordo com a sua atividade na carninogênese esse grupo viral foi dividido em tipos de baixo e de alto risco oncogênico. O Brasil ainda não possui uma quantidade representativa de dados relacionados à prevalência de infecção por HPV, os dados de incidência do vírus são obtidos através da análise de portadores de carcinoma invasivo de colo uterino, neoplasias intraepiteliais cervicais e outros tipos de infecções associadas. Ensaios moleculares vêm mostrando ao longo dos anos uma alta sensibilidade e especificidade na detecção do DNA do HPV. Atualmente são utilizadas técnicas de hibridização como método de escolha para a detecção do DNA viral. Em muitos estudos a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com a aplicação dos primers MY09 e MY11 demonstrou eficiência no rastreamento viral, consequentemente, o desenvolvimento desse diagnóstico molecular possibilitaria o monitoramento da doença, diminuindo as taxas de mortalidade causada pelo câncer de colo do útero. O sequenciamento de DNA é uma metodologia eficiente para a caracterização molecular dos tipos virais, permitindo a realização do alinhamento por similaridade das sequencias obtidas com outras já identificadas e depositadas no GenBank. O presente trabalho teve como propósito identificar os diferentes tipos de HPV e a presença de co-infecções, através de PCR e sequenciamento de uma região hipervariável do gene L1. A amostra estudada foi composta de 515 voluntárias das quais 111 (21,55%) apresentaram a presença do DNA do HPV. Entre os espécimes encontrados 50% são considerados de alto risco oncogênico (maior incidência dos tipos 16 e 58) e 7,21% possuíam infecção múltipla. A determinação das sequencias de base do gene L1 é fundamental para a identificação do tipo viral. Entretanto o sequenciamento do gene completo e em ambos os sentidos da cadeia de DNA se tornam inviáveis financeiramente para a maioria dos laboratórios especializados. Uma abordagem prática aplicada no estudo foi determinar a sequencia de uma região específica do gene L1 contendo 450pb, sendo possível a identificação do HPV seguindo essa metodologia. As técnicas utilizadas mostraram a necessidade da aplicação de um diagnóstico viral mais sensível e específico, contribuindo para o controle da infecção viral e para a diminuição da incidência e da mortalidade causadas pelo câncer cervical.