A espécie humana sempre foi fascinada pela variação de cor exibida pelos animais. Atualmente, investigações genéticas têm permitido que os pesquisadores caracterizem os mecanismos moleculares envolvidos na produção de pigmentos que afetam fenótipos de cor bem como na percepção de tal variação de cor entre diferentes espécies. Essa tese apresenta três investigações sobre esses assuntos. Na primeira, foi estudada a base molecular para a evolução da cor de plumagem em Ramphastidae. Essa família de aves inclui tucanos, araçaris e saripocas, possuindo uma ampla variação em plumagem. Foi encontrada seleção positiva no gene do receptor da melanocortina-1 (MC1R) no ramo que leva ao gênero Ramphastos, sugerindo que a plumagem mais escura nessas espécies foi favorecida pela seleção natural. Interessantemente, três de cinco substituições de aminoácido encontradas nesse gênero foram associadas ao melanismo em outras espécies de aves. No segundo estudo, uma análise do gene MC1R foi geia em perus domésticos (Meleagris gallopavo) brancos e pigmentados. Esse gene é um dos pelo menos cinco locos genéticos conhecidos que determinam a cor da plumagem nessa espécie, e três alelos funcionais já foram caracterizados (B, b+, b1). Os resultados mostraram que as aves brancas têm alguma diversidade genética em nível de DNA, mas quase todos os alelos foram b+, com um único alelo b1 encontrado, sugerindo que essas aves têm um valor limitado para o cruzamento e desenvolvimento de novas variedades coloridas. Entre as aves coloridas, os resultados mostraram que a classificação fenotípica da plumagem feita pelos criadores brasileiros não é preditiva para os alelos que podem ser encontrados no gene MC1R. Finalmente, no terceiro estudo a base molecular da visão colorida em uacari (Cacajao calvus) foi explorada. Essa é uma espécie de primata do Novo Mundo que exibe uma distintiva face avermelhada intensa, um sistema social complexo, e uma dieta especializada. O loco da opsina ligado ao cromossomo X foi caracterizado, e os resultados revelaram a ocorrência de extensivo polimorfismo molecular e o maior número de alelos funcionais (seis) já encontrados em uma espécie de primata. Esse achado provavelmente deriva de seleção para visão tricromática, talvez mediada por seleção sexual. Em conjunto, esses resultados mostram a importância de estudos moleculares que permitam uma melhor compreensão da evolução e manutenção da variação biológica associada à produção e percepção de cores em diferentes grupos de vertebrados. / Humans have been always fascinated by body color variation in animals. Current genetic investigations have allowed researchers to characterize the molecular mechanisms involved in the production of pigments affecting color phenotypes, as well as in the perception of such color variation among different species. This thesis presents three investigations concerning these subjects. In the first, the molecular basis for the evolution of plumage coloration in Ramphastidae was studied. This bird family includes toucans and toucanets, showing wide plumage variation. Positive selection in the melanocortin-1 receptor (MC1R) gene was found in the branch leading to the genus Ramphastos, suggesting that the darker plumage in these species was favored by natural selection. Interestingly, three out of five aminoacid substitutions found in this genus have been associated to melanism in other bird species. In the second study, an analysis of the MC1R gene was performed in white and pigmented domestic turkeys (Meleagris gallopavo). This gene is one of the at least five genetic loci known to determine plumage color in this species, and three functional alleles have been identified (B, b+, b1). The results showed that white birds have some genetic diversity at the DNA level, but almost all alleles were b+, with a single b1 allele found, suggesting that these birds have a limited value for breeding new color varieties. Among colored birds, the results showed that the plumage phenotypic classification used by Brazilian breeders is not predictive of the alleles that can be found in the MC1R gene. Finally, in the third study, the basis of color vision in uakari (Cacajao calvus) was explored. This is a species of New World primate exhibiting a distinctive intense red face, a complex social system, and a specialized diet. The X-lined Opsin locus was characterized, and the results revealed the occurrence of extensive molecular polymorphism and the largest number of functional alleles (six) ever found for a primate. This finding possibly derives from selection for trichromatic vision, perhaps mediated by sexual selection. Taken together, these results show the importance of molecular studies allowing a better understanding of the evolution and maintenance of biological variation associated to color production and perception in different vertebrate groups.

A espécie humana sempre foi fascinada pela variação de cor exibida pelos animais. Atualmente, investigações genéticas têm permitido que os pesquisadores caracterizem os mecanismos moleculares envolvidos na produção de pigmentos que afetam fenótipos de cor bem como na percepção de tal variação de cor entre diferentes espécies. Essa tese apresenta três investigações sobre esses assuntos. Na primeira, foi estudada a base molecular para a evolução da cor de plumagem em Ramphastidae. Essa família de aves inclui tucanos, araçaris e saripocas, possuindo uma ampla variação em plumagem. Foi encontrada seleção positiva no gene do receptor da melanocortina-1 (MC1R) no ramo que leva ao gênero Ramphastos, sugerindo que a plumagem mais escura nessas espécies foi favorecida pela seleção natural. Interessantemente, três de cinco substituições de aminoácido encontradas nesse gênero foram associadas ao melanismo em outras espécies de aves. No segundo estudo, uma análise do gene MC1R foi geia em perus domésticos (Meleagris gallopavo) brancos e pigmentados. Esse gene é um dos pelo menos cinco locos genéticos conhecidos que determinam a cor da plumagem nessa espécie, e três alelos funcionais já foram caracterizados (B, b+, b1). Os resultados mostraram que as aves brancas têm alguma diversidade genética em nível de DNA, mas quase todos os alelos foram b+, com um único alelo b1 encontrado, sugerindo que essas aves têm um valor limitado para o cruzamento e desenvolvimento de novas variedades coloridas. Entre as aves coloridas, os resultados mostraram que a classificação fenotípica da plumagem feita pelos criadores brasileiros não é preditiva para os alelos que podem ser encontrados no gene MC1R. Finalmente, no terceiro estudo a base molecular da visão colorida em uacari (Cacajao calvus) foi explorada. Essa é uma espécie de primata do Novo Mundo que exibe uma distintiva face avermelhada intensa, um sistema social complexo, e uma dieta especializada. O loco da opsina ligado ao cromossomo X foi caracterizado, e os resultados revelaram a ocorrência de extensivo polimorfismo molecular e o maior número de alelos funcionais (seis) já encontrados em uma espécie de primata. Esse achado provavelmente deriva de seleção para visão tricromática, talvez mediada por seleção sexual. Em conjunto, esses resultados mostram a importância de estudos moleculares que permitam uma melhor compreensão da evolução e manutenção da variação biológica associada à produção e percepção de cores em diferentes grupos de vertebrados. / Humans have been always fascinated by body color variation in animals. Current genetic investigations have allowed researchers to characterize the molecular mechanisms involved in the production of pigments affecting color phenotypes, as well as in the perception of such color variation among different species. This thesis presents three investigations concerning these subjects. In the first, the molecular basis for the evolution of plumage coloration in Ramphastidae was studied. This bird family includes toucans and toucanets, showing wide plumage variation. Positive selection in the melanocortin-1 receptor (MC1R) gene was found in the branch leading to the genus Ramphastos, suggesting that the darker plumage in these species was favored by natural selection. Interestingly, three out of five aminoacid substitutions found in this genus have been associated to melanism in other bird species. In the second study, an analysis of the MC1R gene was performed in white and pigmented domestic turkeys (Meleagris gallopavo). This gene is one of the at least five genetic loci known to determine plumage color in this species, and three functional alleles have been identified (B, b+, b1). The results showed that white birds have some genetic diversity at the DNA level, but almost all alleles were b+, with a single b1 allele found, suggesting that these birds have a limited value for breeding new color varieties. Among colored birds, the results showed that the plumage phenotypic classification used by Brazilian breeders is not predictive of the alleles that can be found in the MC1R gene. Finally, in the third study, the basis of color vision in uakari (Cacajao calvus) was explored. This is a species of New World primate exhibiting a distinctive intense red face, a complex social system, and a specialized diet. The X-lined Opsin locus was characterized, and the results revealed the occurrence of extensive molecular polymorphism and the largest number of functional alleles (six) ever found for a primate. This finding possibly derives from selection for trichromatic vision, perhaps mediated by sexual selection. Taken together, these results show the importance of molecular studies allowing a better understanding of the evolution and maintenance of biological variation associated to color production and perception in different vertebrate groups.

A espécie humana sempre foi fascinada pela variação de cor exibida pelos animais. Atualmente, investigações genéticas têm permitido que os pesquisadores caracterizem os mecanismos moleculares envolvidos na produção de pigmentos que afetam fenótipos de cor bem como na percepção de tal variação de cor entre diferentes espécies. Essa tese apresenta três investigações sobre esses assuntos. Na primeira, foi estudada a base molecular para a evolução da cor de plumagem em Ramphastidae. Essa família de aves inclui tucanos, araçaris e saripocas, possuindo uma ampla variação em plumagem. Foi encontrada seleção positiva no gene do receptor da melanocortina-1 (MC1R) no ramo que leva ao gênero Ramphastos, sugerindo que a plumagem mais escura nessas espécies foi favorecida pela seleção natural. Interessantemente, três de cinco substituições de aminoácido encontradas nesse gênero foram associadas ao melanismo em outras espécies de aves. No segundo estudo, uma análise do gene MC1R foi geia em perus domésticos (Meleagris gallopavo) brancos e pigmentados. Esse gene é um dos pelo menos cinco locos genéticos conhecidos que determinam a cor da plumagem nessa espécie, e três alelos funcionais já foram caracterizados (B, b+, b1). Os resultados mostraram que as aves brancas têm alguma diversidade genética em nível de DNA, mas quase todos os alelos foram b+, com um único alelo b1 encontrado, sugerindo que essas aves têm um valor limitado para o cruzamento e desenvolvimento de novas variedades coloridas. Entre as aves coloridas, os resultados mostraram que a classificação fenotípica da plumagem feita pelos criadores brasileiros não é preditiva para os alelos que podem ser encontrados no gene MC1R. Finalmente, no terceiro estudo a base molecular da visão colorida em uacari (Cacajao calvus) foi explorada. Essa é uma espécie de primata do Novo Mundo que exibe uma distintiva face avermelhada intensa, um sistema social complexo, e uma dieta especializada. O loco da opsina ligado ao cromossomo X foi caracterizado, e os resultados revelaram a ocorrência de extensivo polimorfismo molecular e o maior número de alelos funcionais (seis) já encontrados em uma espécie de primata. Esse achado provavelmente deriva de seleção para visão tricromática, talvez mediada por seleção sexual. Em conjunto, esses resultados mostram a importância de estudos moleculares que permitam uma melhor compreensão da evolução e manutenção da variação biológica associada à produção e percepção de cores em diferentes grupos de vertebrados. / Humans have been always fascinated by body color variation in animals. Current genetic investigations have allowed researchers to characterize the molecular mechanisms involved in the production of pigments affecting color phenotypes, as well as in the perception of such color variation among different species. This thesis presents three investigations concerning these subjects. In the first, the molecular basis for the evolution of plumage coloration in Ramphastidae was studied. This bird family includes toucans and toucanets, showing wide plumage variation. Positive selection in the melanocortin-1 receptor (MC1R) gene was found in the branch leading to the genus Ramphastos, suggesting that the darker plumage in these species was favored by natural selection. Interestingly, three out of five aminoacid substitutions found in this genus have been associated to melanism in other bird species. In the second study, an analysis of the MC1R gene was performed in white and pigmented domestic turkeys (Meleagris gallopavo). This gene is one of the at least five genetic loci known to determine plumage color in this species, and three functional alleles have been identified (B, b+, b1). The results showed that white birds have some genetic diversity at the DNA level, but almost all alleles were b+, with a single b1 allele found, suggesting that these birds have a limited value for breeding new color varieties. Among colored birds, the results showed that the plumage phenotypic classification used by Brazilian breeders is not predictive of the alleles that can be found in the MC1R gene. Finally, in the third study, the basis of color vision in uakari (Cacajao calvus) was explored. This is a species of New World primate exhibiting a distinctive intense red face, a complex social system, and a specialized diet. The X-lined Opsin locus was characterized, and the results revealed the occurrence of extensive molecular polymorphism and the largest number of functional alleles (six) ever found for a primate. This finding possibly derives from selection for trichromatic vision, perhaps mediated by sexual selection. Taken together, these results show the importance of molecular studies allowing a better understanding of the evolution and maintenance of biological variation associated to color production and perception in different vertebrate groups.

A coloração dos animais é uma característica que apresenta uma grande diversidade de fenótipos nas diferentes espécies. Diferentes abordagens podem ser utilizadas para o entendimento da diversidade na coloração existente nas espécies animais. Através da análise de genes candidatos as mutações responsáveis pela variação na coloração têm sido descritas em diferentes espécies, demonstrando o envolvimento de mecanismos moleculares variados na sua regulação. Este trabalho tem por objetivo a utilização de duas abordagens genéticas para o estudo da variação na coloração, a análise de genes candidatos e a predição computacional do efeito de polimorfismos não sinônimos. Em ovinos a coloração da lã é uma característica com importância na produção e para a identificação das raças. Polimorfismos em diferentes genes foram associados com a coloração da lã, entretanto, estes não foram estudados em muitas raças que apresentam variação fenotípica. A ovelha crioula é uma raça local existente no sul do Brasil que apresenta uma ampla diversidade de cores na lã, incluindo branco, preto e diversos tons intermediários. O gene receptor de melanocortina 1 (MC1R) foi previamente associado com a coloração na raça crioula, entretanto, outros genes também devem estar envolvidos na regulação da coloração na raça. Este trabalho avaliou a influência dos genes MC1R, ASIP (proteína sinalizadora agouti), TYRP1 (proteína relacionada à tirosinase 1) e KIT (homólogo do oncogene de sarcoma felino viral v-kit Hardy-Zuckerman 4) na coloração da lã na raça ovina crioula. Amostras de 410 animais de diferentes cores foram analisadas, sendo a variação na coloração da lã determinada por colorimetria. O padrão de herança dos fenótipos foi avaliado através de cruzamentos dirigidos entre indivíduos de diferentes cores. Os polimorfismos nos genes foram avaliados através da realização do sequenciamento e da análise de fragmentos e a quantificação da expressão do gene ASIP foi realizada por PCR em Tempo Real. Foi observada a associação significativa entre polimorfismos nos genes MC1R e ASIP e a cor da lã na raça crioula. O alelo dominante do gene MC1R, provocado pelas mutações p.M73K e p.D121N, foi encontrado apenas em indivíduos pigmentados. Este alelo resulta na ativação constitutiva do receptor, e consequentemente na produção constante de eumelanina, sendo epistático sobre o gene ASIP. Nos animais homozigotos para o alelo selvagem do MC1R a manifestação do fenótipo branco ocorreu somente nos portadores de um alelo contendo a duplicação do gene ASIP. Os portadores da duplicação do ASIP apresentaram níveis elevados de expressão do gene enquanto os homozigotos para a cópia simples do ASIP não expressaram o gene e apresentaram fenótipos pigmentados. Os resultados obtidos permitiram identificar a influência da interação epistática dos genes MC1R e ASIP na coloração da lã nos ovinos crioulos. O estudo de genes candidatos envolvidos na rota da pigmentação mostrou-se uma abordagem adequada para a análise da variação na coloração nestes animais. Espera-se que o conhecimento adquirido neste trabalho auxilie na criação e na preservação da raça através da manutenção da diversidade fenotípica existente. A avaliação computacional dos polimorfismos não sinônimos vem sendo utilizada recentemente a fim de determinar os SNPs que potencialmente afetam o funcionamento dos genes e identificar os mecanismos responsáveis por doenças complexas e pela variação nos fenótipos. A predição do efeito de polimorfismos nos genes utilizando ferramentas computacionais apresenta-se como uma abordagem alternativa para o estudo da genética da coloração. O gene MC1R humano apresenta uma grande quantidade de polimorfismos alguns dos quais foram associados com a variação na pigmentação e com suscetibilidade a tumores de pele. Entretanto, muitas das variações existentes no gene não foram avaliadas quanto às suas consequências funcionais e o seu papel na variação da pigmentação. Foi realizada a predição computacional dos polimorfismos não sinônimos no gene MC1R humano com o objetivo de identificar os nsSNPs mais provavelmente danosos, e estabelecer aqueles com potencial efeito na função do MC1R. Foram utilizadas 11 ferramentas de predição individuais (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO e SNAP) e dois programas consenso (PON-P e PredictSNP 1.0) para a análise de 92 nsSNPs localizados no gene. Os programas utilizados baseiam-se em métodos evolutivos, estruturais e computacionais, resultando na identificação dos 14 nsSNPs mais danosos (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R e R306H). Apesar das diferenças nos resultados de cada programa a combinação dos diferentes métodos permitiu diferenciar os polimorfismos neutros dos danosos, mostrando concordância com os programas consenso. A predição computacional demonstrou ser uma abordagem eficiente para a identificação dos alelos danosos no gene MC1R e para a priorização de mutações para posteriores estudos funcionais e populacionais. / Animal color is a characteristic that presents a large diversity of phenotypes. Different approaches can be used to understand the color diversity existing among and within species. Through analysis of candidate genes the mutations responsible for the color variation have been described in different species, showing the involvement of various molecular mechanisms of regulation. The objective of this work is the use of two genetic approaches to the study of color variation, the analysis of candidate genes and the computational prediction of non-synonym polymorphism effects (nsSNPs). In sheep the wool color is a feature with commercial importance and in identifying breeds. Polymorphisms in different genes have been associated with wool color, but they have not been studied in many breeds that show phenotypic variation regarding such a charactere. The Creole is a local breed from southern most Brazil that presents a wide range of wool color, varying from white to black, and including several intermediate hues. The melanocortin 1 receptor (MC1R) was previously associated with the wool color in the Creole, however, other genes might also be involved in the regulation of color in the breed. This study evaluated the influence of the genes MC1R, ASIP (agouti signaling protein), TYRP1 (tyrosinase related protein 1) and KIT (v-kit Hardy- Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) in the Creole breed wool color. Samples from 410 specimens of different colors were analyzed. The variation in the color of the wool was performed by colorimetry. The inheritance pattern of the phenotypes was assessed by crossbreeding individuals of different colors. Polymorphisms in the genes were evaluated by performing sequencing and fragment analysis, and the quantification of the ASIP gene expression was performed by Real Time-PCR. It was observed a significant association between polymorphisms in MC1R and ASIP gene and the wool color in Creole breed. The dominant allele of the MC1R gene, caused by p.M73K and p.D121N mutations was found only in pigmented individuals. This allele leads to the constitutive activation of the receptor and therefore in constant production of eumelanin and is epistatic on the ASIP gene. In the homozygous to the wild-type allele of MC1R the manifestation of white phenotype occurred only in individuals with one allele containing a duplication of the ASIP gene. The carriers of the duplicated copy of ASIP showed high levels of gene expression while homozygous for the simple copy of the ASIP did not expressed the gene, and showed pigmented phenotypes. The results allowed the identification of the influence of epistatic interaction of MC1R and ASIP gene in the wool color in Creole breed. The study of candidate genes involved in the pigmentation pathway proved to be a suitable approach for the analysis of variation in pigmentation in these animals. It is expected that the knowledge acquired in this work will assist on stablishment of commercial breeding and preservation policies of this sheep breed. The computational evaluation of non-synonymous polymorphism has been used to determine SNPs that potentially affect the function of the genes and identify the mechanisms responsible for complex diseases and by the variation in phenotypes. The prediction of the effect of polymorphisms in genes using computational tools presents an alternative approach to the study of the genetic of coloration. The human MC1R gene has a large number of know polymorphisms, some of which were associated with changes in pigmentation and susceptibility to skin tumors. However, many existing variations in the gene have not been evaluated regarding the functional consequences and its role in the variation of pigmentation. Computational prediction of nonsynonymous polymorphisms was performed in the human MC1R gene in order to identify the most likely harmful nsSNPs and to establish those with potential effect on the function of MC1R. Eleven individual tools (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO and SNAP) and two consensus programs (PON-P and PredictSNP 1.0) were used to the analysis of 92 nsSNPs located in the gene. The programs used are based in evolutionary, structural and computational methods, resulting in the identification of the 14 most damaging nsSNPs (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R and R306H). Despite the differences in the results of the each program the combination of different methods allowed the differentiation of the neutral polymorphisms from the most damaging, showing agreement with the consensus programs. The computational prediction has proved to be an efficient approach for the identification of harmful alleles in the MC1R gene and for the prioritization of mutations for further functional and population studies.

A coloração dos animais é uma característica que apresenta uma grande diversidade de fenótipos nas diferentes espécies. Diferentes abordagens podem ser utilizadas para o entendimento da diversidade na coloração existente nas espécies animais. Através da análise de genes candidatos as mutações responsáveis pela variação na coloração têm sido descritas em diferentes espécies, demonstrando o envolvimento de mecanismos moleculares variados na sua regulação. Este trabalho tem por objetivo a utilização de duas abordagens genéticas para o estudo da variação na coloração, a análise de genes candidatos e a predição computacional do efeito de polimorfismos não sinônimos. Em ovinos a coloração da lã é uma característica com importância na produção e para a identificação das raças. Polimorfismos em diferentes genes foram associados com a coloração da lã, entretanto, estes não foram estudados em muitas raças que apresentam variação fenotípica. A ovelha crioula é uma raça local existente no sul do Brasil que apresenta uma ampla diversidade de cores na lã, incluindo branco, preto e diversos tons intermediários. O gene receptor de melanocortina 1 (MC1R) foi previamente associado com a coloração na raça crioula, entretanto, outros genes também devem estar envolvidos na regulação da coloração na raça. Este trabalho avaliou a influência dos genes MC1R, ASIP (proteína sinalizadora agouti), TYRP1 (proteína relacionada à tirosinase 1) e KIT (homólogo do oncogene de sarcoma felino viral v-kit Hardy-Zuckerman 4) na coloração da lã na raça ovina crioula. Amostras de 410 animais de diferentes cores foram analisadas, sendo a variação na coloração da lã determinada por colorimetria. O padrão de herança dos fenótipos foi avaliado através de cruzamentos dirigidos entre indivíduos de diferentes cores. Os polimorfismos nos genes foram avaliados através da realização do sequenciamento e da análise de fragmentos e a quantificação da expressão do gene ASIP foi realizada por PCR em Tempo Real. Foi observada a associação significativa entre polimorfismos nos genes MC1R e ASIP e a cor da lã na raça crioula. O alelo dominante do gene MC1R, provocado pelas mutações p.M73K e p.D121N, foi encontrado apenas em indivíduos pigmentados. Este alelo resulta na ativação constitutiva do receptor, e consequentemente na produção constante de eumelanina, sendo epistático sobre o gene ASIP. Nos animais homozigotos para o alelo selvagem do MC1R a manifestação do fenótipo branco ocorreu somente nos portadores de um alelo contendo a duplicação do gene ASIP. Os portadores da duplicação do ASIP apresentaram níveis elevados de expressão do gene enquanto os homozigotos para a cópia simples do ASIP não expressaram o gene e apresentaram fenótipos pigmentados. Os resultados obtidos permitiram identificar a influência da interação epistática dos genes MC1R e ASIP na coloração da lã nos ovinos crioulos. O estudo de genes candidatos envolvidos na rota da pigmentação mostrou-se uma abordagem adequada para a análise da variação na coloração nestes animais. Espera-se que o conhecimento adquirido neste trabalho auxilie na criação e na preservação da raça através da manutenção da diversidade fenotípica existente. A avaliação computacional dos polimorfismos não sinônimos vem sendo utilizada recentemente a fim de determinar os SNPs que potencialmente afetam o funcionamento dos genes e identificar os mecanismos responsáveis por doenças complexas e pela variação nos fenótipos. A predição do efeito de polimorfismos nos genes utilizando ferramentas computacionais apresenta-se como uma abordagem alternativa para o estudo da genética da coloração. O gene MC1R humano apresenta uma grande quantidade de polimorfismos alguns dos quais foram associados com a variação na pigmentação e com suscetibilidade a tumores de pele. Entretanto, muitas das variações existentes no gene não foram avaliadas quanto às suas consequências funcionais e o seu papel na variação da pigmentação. Foi realizada a predição computacional dos polimorfismos não sinônimos no gene MC1R humano com o objetivo de identificar os nsSNPs mais provavelmente danosos, e estabelecer aqueles com potencial efeito na função do MC1R. Foram utilizadas 11 ferramentas de predição individuais (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO e SNAP) e dois programas consenso (PON-P e PredictSNP 1.0) para a análise de 92 nsSNPs localizados no gene. Os programas utilizados baseiam-se em métodos evolutivos, estruturais e computacionais, resultando na identificação dos 14 nsSNPs mais danosos (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R e R306H). Apesar das diferenças nos resultados de cada programa a combinação dos diferentes métodos permitiu diferenciar os polimorfismos neutros dos danosos, mostrando concordância com os programas consenso. A predição computacional demonstrou ser uma abordagem eficiente para a identificação dos alelos danosos no gene MC1R e para a priorização de mutações para posteriores estudos funcionais e populacionais. / Animal color is a characteristic that presents a large diversity of phenotypes. Different approaches can be used to understand the color diversity existing among and within species. Through analysis of candidate genes the mutations responsible for the color variation have been described in different species, showing the involvement of various molecular mechanisms of regulation. The objective of this work is the use of two genetic approaches to the study of color variation, the analysis of candidate genes and the computational prediction of non-synonym polymorphism effects (nsSNPs). In sheep the wool color is a feature with commercial importance and in identifying breeds. Polymorphisms in different genes have been associated with wool color, but they have not been studied in many breeds that show phenotypic variation regarding such a charactere. The Creole is a local breed from southern most Brazil that presents a wide range of wool color, varying from white to black, and including several intermediate hues. The melanocortin 1 receptor (MC1R) was previously associated with the wool color in the Creole, however, other genes might also be involved in the regulation of color in the breed. This study evaluated the influence of the genes MC1R, ASIP (agouti signaling protein), TYRP1 (tyrosinase related protein 1) and KIT (v-kit Hardy- Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) in the Creole breed wool color. Samples from 410 specimens of different colors were analyzed. The variation in the color of the wool was performed by colorimetry. The inheritance pattern of the phenotypes was assessed by crossbreeding individuals of different colors. Polymorphisms in the genes were evaluated by performing sequencing and fragment analysis, and the quantification of the ASIP gene expression was performed by Real Time-PCR. It was observed a significant association between polymorphisms in MC1R and ASIP gene and the wool color in Creole breed. The dominant allele of the MC1R gene, caused by p.M73K and p.D121N mutations was found only in pigmented individuals. This allele leads to the constitutive activation of the receptor and therefore in constant production of eumelanin and is epistatic on the ASIP gene. In the homozygous to the wild-type allele of MC1R the manifestation of white phenotype occurred only in individuals with one allele containing a duplication of the ASIP gene. The carriers of the duplicated copy of ASIP showed high levels of gene expression while homozygous for the simple copy of the ASIP did not expressed the gene, and showed pigmented phenotypes. The results allowed the identification of the influence of epistatic interaction of MC1R and ASIP gene in the wool color in Creole breed. The study of candidate genes involved in the pigmentation pathway proved to be a suitable approach for the analysis of variation in pigmentation in these animals. It is expected that the knowledge acquired in this work will assist on stablishment of commercial breeding and preservation policies of this sheep breed. The computational evaluation of non-synonymous polymorphism has been used to determine SNPs that potentially affect the function of the genes and identify the mechanisms responsible for complex diseases and by the variation in phenotypes. The prediction of the effect of polymorphisms in genes using computational tools presents an alternative approach to the study of the genetic of coloration. The human MC1R gene has a large number of know polymorphisms, some of which were associated with changes in pigmentation and susceptibility to skin tumors. However, many existing variations in the gene have not been evaluated regarding the functional consequences and its role in the variation of pigmentation. Computational prediction of nonsynonymous polymorphisms was performed in the human MC1R gene in order to identify the most likely harmful nsSNPs and to establish those with potential effect on the function of MC1R. Eleven individual tools (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO and SNAP) and two consensus programs (PON-P and PredictSNP 1.0) were used to the analysis of 92 nsSNPs located in the gene. The programs used are based in evolutionary, structural and computational methods, resulting in the identification of the 14 most damaging nsSNPs (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R and R306H). Despite the differences in the results of the each program the combination of different methods allowed the differentiation of the neutral polymorphisms from the most damaging, showing agreement with the consensus programs. The computational prediction has proved to be an efficient approach for the identification of harmful alleles in the MC1R gene and for the prioritization of mutations for further functional and population studies.

A coloração dos animais é uma característica que apresenta uma grande diversidade de fenótipos nas diferentes espécies. Diferentes abordagens podem ser utilizadas para o entendimento da diversidade na coloração existente nas espécies animais. Através da análise de genes candidatos as mutações responsáveis pela variação na coloração têm sido descritas em diferentes espécies, demonstrando o envolvimento de mecanismos moleculares variados na sua regulação. Este trabalho tem por objetivo a utilização de duas abordagens genéticas para o estudo da variação na coloração, a análise de genes candidatos e a predição computacional do efeito de polimorfismos não sinônimos. Em ovinos a coloração da lã é uma característica com importância na produção e para a identificação das raças. Polimorfismos em diferentes genes foram associados com a coloração da lã, entretanto, estes não foram estudados em muitas raças que apresentam variação fenotípica. A ovelha crioula é uma raça local existente no sul do Brasil que apresenta uma ampla diversidade de cores na lã, incluindo branco, preto e diversos tons intermediários. O gene receptor de melanocortina 1 (MC1R) foi previamente associado com a coloração na raça crioula, entretanto, outros genes também devem estar envolvidos na regulação da coloração na raça. Este trabalho avaliou a influência dos genes MC1R, ASIP (proteína sinalizadora agouti), TYRP1 (proteína relacionada à tirosinase 1) e KIT (homólogo do oncogene de sarcoma felino viral v-kit Hardy-Zuckerman 4) na coloração da lã na raça ovina crioula. Amostras de 410 animais de diferentes cores foram analisadas, sendo a variação na coloração da lã determinada por colorimetria. O padrão de herança dos fenótipos foi avaliado através de cruzamentos dirigidos entre indivíduos de diferentes cores. Os polimorfismos nos genes foram avaliados através da realização do sequenciamento e da análise de fragmentos e a quantificação da expressão do gene ASIP foi realizada por PCR em Tempo Real. Foi observada a associação significativa entre polimorfismos nos genes MC1R e ASIP e a cor da lã na raça crioula. O alelo dominante do gene MC1R, provocado pelas mutações p.M73K e p.D121N, foi encontrado apenas em indivíduos pigmentados. Este alelo resulta na ativação constitutiva do receptor, e consequentemente na produção constante de eumelanina, sendo epistático sobre o gene ASIP. Nos animais homozigotos para o alelo selvagem do MC1R a manifestação do fenótipo branco ocorreu somente nos portadores de um alelo contendo a duplicação do gene ASIP. Os portadores da duplicação do ASIP apresentaram níveis elevados de expressão do gene enquanto os homozigotos para a cópia simples do ASIP não expressaram o gene e apresentaram fenótipos pigmentados. Os resultados obtidos permitiram identificar a influência da interação epistática dos genes MC1R e ASIP na coloração da lã nos ovinos crioulos. O estudo de genes candidatos envolvidos na rota da pigmentação mostrou-se uma abordagem adequada para a análise da variação na coloração nestes animais. Espera-se que o conhecimento adquirido neste trabalho auxilie na criação e na preservação da raça através da manutenção da diversidade fenotípica existente. A avaliação computacional dos polimorfismos não sinônimos vem sendo utilizada recentemente a fim de determinar os SNPs que potencialmente afetam o funcionamento dos genes e identificar os mecanismos responsáveis por doenças complexas e pela variação nos fenótipos. A predição do efeito de polimorfismos nos genes utilizando ferramentas computacionais apresenta-se como uma abordagem alternativa para o estudo da genética da coloração. O gene MC1R humano apresenta uma grande quantidade de polimorfismos alguns dos quais foram associados com a variação na pigmentação e com suscetibilidade a tumores de pele. Entretanto, muitas das variações existentes no gene não foram avaliadas quanto às suas consequências funcionais e o seu papel na variação da pigmentação. Foi realizada a predição computacional dos polimorfismos não sinônimos no gene MC1R humano com o objetivo de identificar os nsSNPs mais provavelmente danosos, e estabelecer aqueles com potencial efeito na função do MC1R. Foram utilizadas 11 ferramentas de predição individuais (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO e SNAP) e dois programas consenso (PON-P e PredictSNP 1.0) para a análise de 92 nsSNPs localizados no gene. Os programas utilizados baseiam-se em métodos evolutivos, estruturais e computacionais, resultando na identificação dos 14 nsSNPs mais danosos (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R e R306H). Apesar das diferenças nos resultados de cada programa a combinação dos diferentes métodos permitiu diferenciar os polimorfismos neutros dos danosos, mostrando concordância com os programas consenso. A predição computacional demonstrou ser uma abordagem eficiente para a identificação dos alelos danosos no gene MC1R e para a priorização de mutações para posteriores estudos funcionais e populacionais. / Animal color is a characteristic that presents a large diversity of phenotypes. Different approaches can be used to understand the color diversity existing among and within species. Through analysis of candidate genes the mutations responsible for the color variation have been described in different species, showing the involvement of various molecular mechanisms of regulation. The objective of this work is the use of two genetic approaches to the study of color variation, the analysis of candidate genes and the computational prediction of non-synonym polymorphism effects (nsSNPs). In sheep the wool color is a feature with commercial importance and in identifying breeds. Polymorphisms in different genes have been associated with wool color, but they have not been studied in many breeds that show phenotypic variation regarding such a charactere. The Creole is a local breed from southern most Brazil that presents a wide range of wool color, varying from white to black, and including several intermediate hues. The melanocortin 1 receptor (MC1R) was previously associated with the wool color in the Creole, however, other genes might also be involved in the regulation of color in the breed. This study evaluated the influence of the genes MC1R, ASIP (agouti signaling protein), TYRP1 (tyrosinase related protein 1) and KIT (v-kit Hardy- Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) in the Creole breed wool color. Samples from 410 specimens of different colors were analyzed. The variation in the color of the wool was performed by colorimetry. The inheritance pattern of the phenotypes was assessed by crossbreeding individuals of different colors. Polymorphisms in the genes were evaluated by performing sequencing and fragment analysis, and the quantification of the ASIP gene expression was performed by Real Time-PCR. It was observed a significant association between polymorphisms in MC1R and ASIP gene and the wool color in Creole breed. The dominant allele of the MC1R gene, caused by p.M73K and p.D121N mutations was found only in pigmented individuals. This allele leads to the constitutive activation of the receptor and therefore in constant production of eumelanin and is epistatic on the ASIP gene. In the homozygous to the wild-type allele of MC1R the manifestation of white phenotype occurred only in individuals with one allele containing a duplication of the ASIP gene. The carriers of the duplicated copy of ASIP showed high levels of gene expression while homozygous for the simple copy of the ASIP did not expressed the gene, and showed pigmented phenotypes. The results allowed the identification of the influence of epistatic interaction of MC1R and ASIP gene in the wool color in Creole breed. The study of candidate genes involved in the pigmentation pathway proved to be a suitable approach for the analysis of variation in pigmentation in these animals. It is expected that the knowledge acquired in this work will assist on stablishment of commercial breeding and preservation policies of this sheep breed. The computational evaluation of non-synonymous polymorphism has been used to determine SNPs that potentially affect the function of the genes and identify the mechanisms responsible for complex diseases and by the variation in phenotypes. The prediction of the effect of polymorphisms in genes using computational tools presents an alternative approach to the study of the genetic of coloration. The human MC1R gene has a large number of know polymorphisms, some of which were associated with changes in pigmentation and susceptibility to skin tumors. However, many existing variations in the gene have not been evaluated regarding the functional consequences and its role in the variation of pigmentation. Computational prediction of nonsynonymous polymorphisms was performed in the human MC1R gene in order to identify the most likely harmful nsSNPs and to establish those with potential effect on the function of MC1R. Eleven individual tools (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO and SNAP) and two consensus programs (PON-P and PredictSNP 1.0) were used to the analysis of 92 nsSNPs located in the gene. The programs used are based in evolutionary, structural and computational methods, resulting in the identification of the 14 most damaging nsSNPs (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R and R306H). Despite the differences in the results of the each program the combination of different methods allowed the differentiation of the neutral polymorphisms from the most damaging, showing agreement with the consensus programs. The computational prediction has proved to be an efficient approach for the identification of harmful alleles in the MC1R gene and for the prioritization of mutations for further functional and population studies.